●E-4：質量分析装置を用いたmiRNAの測定データ紹介［特集］第11回医薬ポスターセッション Autoﬂex speed）を用いて測定方法の開発を行った。 E-4：質量分析装置を用いた miRNAの測定データ紹介医薬営業部兼生物科学研究部　廣川　順一 1.はじめに miRNA（マイクロRNA）は、遺伝子の発現を調節する機能を有する長さ20～25残基のRNAであり、タンパク質をコードしないncRNAの一種である。分子量は5000～ 8000 Daで、一般的な検出方法を図1に示す。図3　測定対象の配列 3.それぞれの装置の特徴について図1　miRNAの一般的な検出方法 2種類の質量分析装置の特徴を図4に示す。これらの装置を使用し、高感度に精度よく測定するためにはそれぞこれまでの研究から、miRNAはがん細胞において発現れ化合物にあった測定条件の最適化が必要となる。量が特異的に変化することがわかり、がんの特異的バイ API5000ではカラムや移動相の選定といったLC条件オマーカーとしての有用性が期待されている。図2に乳の検討から、プリカーサーイオンQ1、及びプロダクトイがんに関連するmiRNAを示す。赤字で示すmiRNAはがオンQ3の選択といったMS条件の最適化が必要となる。んで発現量が増加、青字で示すmiRNAは減少することが一方、Autoﬂex speedでは最適なマトリックスを選定わかっている。する必要がある。これらのmiRNAの高精度・高感度な測定法が開発できれば、超早期な乳がん診断が可能となる。図2　がんに関連するmiRNA miRNAの一般的な測定手法は図₁に示した通りであるが、ここでは、2種類の質量分析装置を用いた新たな測定方法を紹介する。 2.測定対象物質の配列図4　2種類の質量分析装置測定対象物質の配列を図3に示す。測定対象として let-7とmiR-92a-2-5pを選択した。 4.API5000によるlet-7分析結果 let-7aは22残基のmiRNAで分子量は7181.2である。 let-7aには、配列の僅かに異なるlet-7 familyが複数存在具体的なプリカーサーイオン選択の事例を紹介する。する。今回は、その中から1～2塩基配列が異なる、let- miRNAは高分子化合物のため、MS検出できない可能 7b、7c、7dを用いて、API5000 LC-MS/MSシステム（以性があるが、多価イオンを検出すれば、検出可能であ下API5000）を用いた定量測定法の開発を行った。る。図4に示した様にAPI5000の質量範囲は1250までと一方、miR-92a-2-5pは、22残基のmiRNAで分子量はなっているため、1250以下が選択対象のイオンとなる。 7180 Daである（図3 ⑤）。配列の長さの異なるmiRNA miRNAのモデル化合物であるlet-7aのプリカーサーイオを7種用意し、Autoﬂex speed MALDI-TOF/MS（以下ンの検出結果を図5に示す。let-7aは分子量が7181.2だ・37 東レリサーチセンター The TRC News No.120（Feb. 2015） ●E-4：質量分析装置を用いたmiRNAの測定データ紹介が、多価イオンのうち、11価のイオン強度を頂点として、それぞれ結晶のできかたには差が見られた。 6価から22価まで検出された。今回、最も感度が良かっ検討した結果、添加剤としてクエン酸を用い、HPA た11価、 m/z 651.8をプリカーサーイオンQ1に設定した。とTCの1：1が最適なマトリックであることがわかっ 4 4 た。結晶のできがイオン化には非常に影響するため、 Autoﬂex speedの最適化においてはこの選定が一番重要なポイントとなる。ここで開発した方法を用いて、miR-92a-2-5pを含む7 種の混合溶液を測定した結果を図8に示す。 10 fmol/mLの濃度の溶液を測定した結果、7つのピークをそれぞれ分離して検出することができた。一方、クエン酸を添加しない場合はナトリウムやカリウムの付加体が検出された。図5　プリカーサーイオン選択の事例 API5000によるlet-7ファミリーの測定結果を図6に示す。上からlet-7a、7b、7c、7dのクロマトグラムを示した。 let-7aの検量線で1.4 fmolから140 fmolまでの直線性が得られた。図8　Autoflex speedによる7種の混合溶液の測定結果 6.まとめ今回2種の異なる装置及びmiRNAを用いて測定を行っ図6　API5000によるlet-7ファミリーの測定結果た。 API5000でlet-7ファミリーの測定を行った結果、1.4～ 140 fmolの間で良好な直線性が得られた。 5.Autoflex speedによるmiR-92a-2-5p分析結果また、Autoﬂex speedを用いたmiR-92-a-2-5pを含む7 マトリックスの構造式とその結晶構造を図7に示す。 HPA:TC=1:1を用いることにより10 fmolの検出感度を達種の混合溶液の測定を行った結果、マトリックスとして成すること、さらに1塩基ずつ異なる合成miRNA混合溶液の分離検出に成功した。図7　マトリックスの構造式とその結晶化の様子 ■廣川　順一（ひろかわ　じゅんいち）医薬営業部兼生物科学研究部　主任部員 3種のマトリックスとしてHPA、SA、DHBを選択し、添加剤としてはクエン酸アンモニウム（TC）を用いた。 38・東レリサーチセンター The TRC News No.120（Feb. 2015）趣味：テニス、読書及びサッカー