電力中央研究所報告先端技術ナノ・マイクロテクノロジーを利用した生物計測技術の開発（その３） −水銀分析のための固相抽出法とマイクロイムノアッセイ− キーワード：水銀，固相抽出，イムノアッセイ，抗体，マイクロ流体デバイス背報告書番号：Ｖ１１０４５景近年、国際的な枠組みによる水銀の排出と輸出入の管理が議論されており、将来的な規制対象の拡大に伴い水銀測定のニーズの増加が予想されることから、今後は簡易で高感度な水銀分析法が望まれる。これまで当所では重金属と反応する抗体を用いた、簡便で高感度なイムノアッセイを開発、実用化している。また、水銀に反応する抗体を見出しているが（1）、水銀を含む試料に適した前処理法が開発されていないため、イムノアッセイの構築には至っていない。目的水銀（Hg2+）を含む試料の簡易な前処理法を構築し、イムノアッセイと組み合わせて簡便かつ迅速な測定の原理を立証する。主な成果 1. イオン交換樹脂を用いた水銀イオンの吸着および溶出イオン交換樹脂を利用した前処理カラムを作製し、試料中の 2 価水銀（100μg/L）を全量吸着しうる樹脂の粒子径や粒子量の条件を見出した。また、吸着した水銀のほぼ全量（97.5%）を溶出可能で、後段のイムノアッセイに有益な組成の溶出液を見出した（図 1）。 2. 共存金属類の排除環境試料において共存が想定しうる金属類（カドミウム等、全 10 種類, 各 100μg/L）を添加した試料を前処理カラムに通液し、吸着と洗浄による除去を検討した。その結果、前処理カラムに対するカドミウム以外のイオンの吸着を抑制し、続く純水洗浄により吸着したカドミウムの全量を除去できた。これにより、溶出液への水銀以外の抗体と反応しうる金属類の影響を排除できた（図 1, 2）。 3. マイクロイムノアッセイによる水銀の測定開発した前処理法を、当所が保有する抗体と既報（2）のマイクロ流体デバイスを用いたマイクロイムノアッセイ（図 3）と組み合わせ、水銀の測定を行った結果、測定範囲は 1.1 – 5.1μg/L、検出下限値は 0.6μg/L であり、廃棄物処理法が定める埋立処分に係る溶出量基準（5μg/L 以下）を満足することが示された（図 4）。本報で構築した水銀を含む試料の前処理法と、それに続く水銀測定により、国内において初めてのイムノアッセイを利用した実用的な水銀分析法を提案した。今後の展開電気事業における環境管理への活用のため、環境試料で想定される妨害物質の測定への影響を検討するとともに、定量範囲の拡大も図る。試料（前処理前）前処理カラム作製濃度 [μg/L] 塩酸濃度: 0.1M HCl, 5ml 全量水銀を吸着. カドミウムを除く共存金属類の吸着抑制(<1.5%). コンディショニング 100 80 60 40 20 0 Mn 試料溶液送液 Mg Fe Zn Cd Cu Hg Cu Hg 洗浄 (純水, 15mL) カドミウムの完全な除去. 溶出液（前処理後）溶出率 [%] 洗浄溶出液:10uM EDTA-4Na 50mM Tris(pH7.5), 10ml 溶出水銀の全量(97.5%)を回収 100 80 60 40 20 0 Mn Mg Fe Zn Cd イムノアッセイによる測定図 1 前処理・測定の流れと各操作側鎖に三級アミンを有し、金属類を吸着しうるイオン交換樹脂を用いて作製した前処理カラムと、最適化した前処理により、水銀イムノアッセイにおいて競合となるカドミウム等の共存金属類の影響を完全に排除し、試料溶液中のほぼ全量の水銀の溶出できた。図 2 水銀抽出と共存金属の排除試料中の水銀を除く金属類（各 100μg/L）は、前処理により、除去された。抗原抗体反応水銀‐EDTA Y ＋ Hg 測定範囲: 1.1-5.1 μg/L 検出下限: 0.6 μg/L 定量下限: 3.2 μg/L 100 Hg Y マイクロ流体デバイス相対信号値 [%] 抗体 80 60 40 20 9.0ppb 0 0.1 1 10 100 1000 制御用ＰＣ + 吸光度測定装置試料溶液中の水銀濃度 [μg/L] 図 3 マイクロイムノアッセイの概要水銀-EDTA 錯体と抗体を混合し、マイクロ流体デバイスを利用したフロー式イムノアッセイに供した。図 4 マイクロイムノアッセイによる標準曲線水銀および 10 種の金属類（100μg/L）を含む試料について前処理に供し、続いてイムノアッセイにより測定した。関連研究報告書（1）V980501「環境モニタリングを目的としたモノクローナル抗体の開発（4）」（2006.4）（2）V10031「ナノ・マイクロテクノロジーを利用した生物計測技術の開発（その 2）」（2011.5）研究担当者伊達安基（環境科学研究所バイオテクノロジー領域）問い合わせ先電力中央研究所環境科学研究所研究管理担当スタッフ Tel. 04-7182-1181(代) E-mail : [email protected] 報告書の本冊（PDF 版）は電中研ホームページ http://criepi.denken.or.jp/よりダウンロード可能です。［非売品・無断転載を禁じる］ © 2012 CRIEPI 平成２４年６月発行１１−００７