生体分子有機化学 2014年12月18日分第11回：発酵・他、クエン酸サイクル - - 生体反応が連続的に機能し、生体の恒常性を維持する一例として『解糖』を理解する。! 発酵、その他の糖代謝の役割について理解する。! ピルビン酸の使い方を学ぶ。! ミトコンドリアやクエン酸サイクルの概要を知る。担当：岸村顕広 2 参考文献『ヴォート基礎生化学』! (東京化学同人) 『マッキー生化学』 (化学同人) 予習用教材。! （第８回以降は、! 3-5章に対応。）化学反応機構、タンパク質構造が詳しい。本気の方には、! 『ヴォート生化学』! （２倍のボリューム）! をお薦めします。イラストが豊富前回のQuiz ピルビン酸は、生体内で還元されて乳酸となることが知られており、この反応は次式で示される。（これをホモ乳酸発酵といい、NAD+が再生されるのが重要である。）! この反応は、乳酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるが、活性部位に配置された２つのアルギニン残基と一つのプロトン化されたヒスチジン残基が反応に関与しているらしい。想定される反応機構を述べよ。（よくわからない場合は、２つ目のアルギニンは無視して良い。）アルギニン + プロトン化されたヒスチジン + H 2 ＊今回の講義に関する質問、リクエスト、その他感想などがあれば、それも書いて下さい。! ＊名前と学籍番号も書いて下さい。 Quiz解説考える上で何が重要か？ Nu (1) 基質の固定：超分子的相互作用! (2) 反応の立体化学の制御：ヒドリドの攻撃方向! (3) 反応の推進：プロトンの授受、カルボニルの活性化 2 H + プロトンの! 受け渡し方向 + 2 + 正電荷による反応の活性化、反応面の固定。 O O 3 – CH がっちり固定 O CH 3 O 2点でカルボニル基の π結合 O– O O H– O –O H 3C O H– どちらがL体を与えるか？ (1) Arg 171で固定。! (2) Arg 109とHis 195で基質の向きを整えつつ、プロトンのスムーズな受け渡しを準備。 R HN Arg 171 O 下 NAD+ Arg 109 H 2N + + H 2N NH 2 – O 上 H 3C H HO O NH 2 H H 3C NH His 195 N O– L-乳酸 OH R N NH 2 H R + R O NH 酵素（補足）D, L-表記法単糖や関連する化合物、ヒドロキシ酸では、グリセルアルデヒドを基準に立体配置の呼び方を決める。 CHO H COOH CHO OH HO H HO H CH2OH CH2OH D-グリセルアルデヒド CH3 L-グリセルアルデヒド L-乳酸アミノ酸では、セリンを基準に決める。 COOH H NH 2 COOH H 2N H CH2OH CH2OH D-セリン L-セリン生体内のタンパク質は L体のアミノ酸で構成されている。アルデヒド、ケトン、カルボン酸を上に配置。グリセルアルデヒドと比べる CHO H OH D H L H OH D H OH D 最も下の不斉炭素で決める。 HO CH2OH D-グルコース＊DL表記法は、旋光性を示すのに用いられるdl表記とは異なる。糖代謝の概要解糖の全反応：解糖 C6H12O6 グルコースグルコース + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi ! → 2ピルビン酸 + 2NADH + 2ATP + 2H2O + 4H+ 2NAD+ ＊実際には2ATPを使って、4ATPを回収する。『アメリカ版 大学生物学の教科書』! 2ATP 2NADH p. 210-214参照。 2ピルビン酸 2C3H4O3 好気条件で酸化嫌気条件で 嫌気条件で ホモ乳酸発酵アルコール発酵クエン酸! サイクル 2NADH 2NADH 2NAD+ 6O2 酸化的 リン酸化 2NAD+ 2乳酸 6CO2 + 6H2O 2NADH 2NAD+ 2CO2 + エタノール解糖：まとめ前半 x2 NAD+ 投資 1. リン酸化 HK GAPDH 酸化 ADP NADH PGK 後半 6. 高エネルギー化合物生成還元力 7. 基質レベルのリン酸化 ATP 2. 異性化 8. リン酸基の移動投資 3. リン酸化 PFK エノラーゼ 9. 高エネルギー化合物生成アルドラーゼ 4. 開裂 5. 等価交換 ADP PK ATP 10. 基質レベルのリン酸化全反応: グルコース + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2ピルビン酸 + 2NADH + 2ATP + 2H2O + 4H+ 解糖に登場する高エネルギー化合物 “~”は高エネルギー結合の意味 ADPをATPに再生するのが目標。アシルリン酸! （酸無水物）ホスホエノールピルビン酸 1,3-ビスホスホグリセリン酸 - 加水分解により、共鳴安定化し、水和エネルギーが増す。! 置換反応に対する活性が高い。! - 静電反発解消もあると思われる。 - ホスホクレアチンエノールリン酸グルコース-6-リン酸 (G6P) グリセロール-3-リン酸 - 加水分解後に生ずる、エノールの互変 - 異性により安定化。! 静電反発解消、水和エネルギー上昇の効果もあると思われる。（おさらい）ATP生成のエネルギー収支反応6と7でのエネルギー収支 6. ΔGが小さく正であり、不利。 7. ΔGが大きく負であり、有利。反応10でのエネルギー収支全体として発エルゴン的に進む。! （反応７が反応６を牽引する。）加水分解 ΔG°’ = –16 kJ/mol 異性化 ΔG°’ = –46 kJ/mol 全反応 ΔG°’ = –61.9 kJ/mol エノール体がケト体に互変異性化する時により大きな安定化エネルギーが放出される。解糖の制御・調節（１）代謝流量の制御・調節は生体の恒常性維持に必須である。不可逆ヘキソキナーゼ近平衡 PFK ΔG 流量調節に有効不可逆近平衡 PK (標準) (実際) 筋肉では、休んでいる時と激しく活動している時で、 ATP濃度は10%しか変わらないが、 流量は100倍近く変わることがある。ホスホフルクトキナーゼによるATP生産量の調節は…! - 基質のATPによるアロステリック制御! - AMPによる阻害解除! - 基質サイクル! (- 遺伝子発現の調節) 不可逆筋肉におけるホスホフルクトキナーゼ(PFK)の調節基質サイクルホスホフルクトキナーゼの活性 ATPによるアロステリック制御不可逆反応にける、別経路の逆向き反応によるサイクル。阻害剤なし(低ATP濃度) 休息時活動時 PFK PFK↑ 1 mM ATP + 0.1 mM AMP 約1/7 1 mM ATP FBP アーゼ FBP アーゼフルクトース-6-リン酸濃度 (mM) AMPによる阻害の解除アデニル酸キナーゼ 2ADP ATP + AMP [ATP][AMP] K= [ADP]2 = 0.44 基質サイクルは、一見無駄に見えるが、高活性を持続的に発揮する状態に急激に移るために有用。また、体熱の大部分を基質サイクルによりまかなっているらしい。 ATPが不足するとADP２つから供給。 その際にAMP濃度が上昇し、効果的に阻害解除。 FBPアーゼ: フルクトース-1,6ビスホスファタ−ゼ 13 ピルビン酸キナーゼ(PK) アロステリック制御になっている! (図中では、フルクトース-1,6-ビスリン酸; FBPが制御分子の場合は、正の効果。) →FBPの増加でATP生産を加速制御サイト高濃度のATPで不活性化、! 高濃度のAMPで活性化、するらしい。 PDB 1a3w! (酵母由来だそうです。) 活性サイト! 緑：金属イオン(Mn, K)! ＊これらのキナーゼでは、Mgでなく、Mnが活性サイトにあることもあるらしい。解糖グルコース : 活性化解糖の制御・調節（２） : 阻害ヘキソキナーゼグルコース-6-リン酸フルクトース-6-リン酸ホスホフルクトキナーゼフルクトース-1,6-ビスリン酸ホスホエノールピルビン酸ピルビン酸キナーゼピルビン酸『アメリカ版大学生物学の教科書』! p. 248-252参照。 14 発酵嫌気条件（酸素のない条件）で、NAD+を再生するためのプロセス。! 動物では筋肉でホモ乳酸発酵が起こる。酵母ではアルコール発酵が起こる。 →解糖は、とても速いプロセスなので、筋肉などのATP消費が速い組織でよく行われる。１グルコースあたりの燃費の意味では、酸化的リン酸化（次回以降; 速度は解糖の100分の1）の方が良い。 →乳酸は、肝臓などでグルコースへと戻される。アルコール発酵（酵母）ピルビン酸は グルコース残りカスではない!! 2ATP CO2 パン解糖ピルビン酸酸化的 リン酸化ピルビン酸! (アセチル+炭酸) 発酵 NADH 32ATP CO2 O2が必要。アセトアルデヒド NAD+ エタノール乳酸 CO2 エタノール O2不要。酒『アメリカ版大学生物学の教科書』! p. 223-226参照。グルコースが関連する代謝のまとめペントースリン酸経路核酸合成用のペントースを合成するだけでなく、NADPHを生産するという重要な役割を担っている経路。 ATP：エネルギー通貨。 NAD+/NADH：ATP生産に必須の酸化力通貨。![NAD+]/[NADH]~1,000 NADP+/NADPH：生合成系のための還元力通貨。![NADP+]/[NADPH]~0.01 ! 例) コレステロールの生合成系（以前に紹介済み）脱炭酸 NADPH + H+ NADPH + CO2 NADP+ NADP+ グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼグルコース-6-リン酸 (G6P) 6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ 6-ホスホグルコノδ-ラクトン 6-ホスホグルコン酸リブロース-5-リン酸! (Ru5P) 以下、可逆反応で解糖プロセスへ 3G6P + 6NADP+ + 3H2O 全反応: ! → 6NADPH + 6H+ + 3CO + 2F6P + GAP 2 リボース-5-リン酸イソメラーゼリボース-5-リン酸! (R5P) 呼吸バースト食細胞における殺菌機構：スーパーオキシドアニオンの生成! →ファゴソームに取り込んだあとに活性酸素などで攻撃。病原体などの異物食細胞! (マクロファージ、好中球など) ファゴソームに取り込みペントースリン酸経路 →酸素はエネルギー生産に必要だが、一歩間違うと凶器にもなりうる。 →体内では、抗酸化物質（ビタミンC,ビタミンEなど）が重要。 18 ペントースリン酸経路の位置づけヌクレオチド合成にも進めるが、解糖にも合流可能。! ! →NADPHだけ必要な時は、解糖に向かう。ペントースリン酸経路解糖グルコースが関連する代謝のまとめグリコーゲン - 分岐構造のグルコースのポリマー。末端から分解されるので、枝分かれが多いと急激なグルコース需要に対応しやすい。! - ２分岐が約12回繰り返される。約12残基が一つの枝を構成している。! - 球状構造体。小さい容積に多量のグルコースが貯蔵できる仕組み。分解非還元 末端 - 非還元末端がリン酸化されつつ切り取られる。 →グルコース-1-リン酸が生成 →G6Pに変換されて代謝経路へ枝分かれ還元末端電子顕微鏡写真デンドリマーなどと比較すると面白い。 - 外側に行くほど密度が高まる。! ! →サイズに上限が生じる。! - 分岐世代が上がると球状構造。糖新生基本的には、解糖の逆行でグルコースを合成できる（糖新生）。! 不可逆反応を乗り越えるために、別の反応経路が用意されている。グルコース-6- ホスファターゼ解糖 +2ATP フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ +2ATP –6ATP →4ATPのコストをかけて経路調節を守っている。ピルビン酸カルボキシラーゼ! (ビオチンが補欠分子）糖新生 –6ATP ピルビン酸ホスホエノールピルビン酸オキサロ酢酸 HCO3– + ATP PEPカルボキシキナーゼオキサロ酢酸ピルビン酸 GTP CO2 + GDP ホスホエノールピルビン酸グルコース以外の糖（ヘキソース）の代謝についてうまく解糖プロセスに乗せるように変換が行われている。 ATP 4ステップ ATP 2ステップ ATP 1ステップ 2ATP 3 or 7ステップ ATP 糖代謝の概要ミトコンドリアを舞台に、好気的代謝が行われる。! 全体で、ピルビン酸を３つのCO2に変える。解糖 C6H12O6 アセチルCoAの生成：グルコースピルビン酸 + NAD+ + CoASH ! → アセチルCoA + NADH + CO2 + H+ (ΔG°’ = –33.5 kJ/mol) 2NAD+ 2ATP クエン酸サイクルの全反応： 2NADH 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + アセチルCoA ! → 3NADH + FADH2 + GTP + CoASH + 2CO2 2ピルビン酸 2C3H4O3 (酸化的リン酸化に備えて還元力を貯めこむ。) 嫌気条件で ホモ乳酸発酵好気条件で酸化アセチルCoA クエン酸! サイクル 2NADH 2NADH 2NAD+ 6O2 酸化的 リン酸化 2NAD+ 2乳酸 6CO2 + 6H2O 嫌気条件で アルコール発酵酸化的に代謝する経路であるだけでなく、同化のための合成原料を提供する代謝のハブ。 2NADH 2NAD+ 2CO2 + エタノール『アメリカ版 大学生物学の教科書』! p. 216-222参照。異化代謝の流れ（再）食物消化: 胃、小腸などで小さな分子へ分解! →細胞レベルでの吸収 ADP NAD+ 解糖 ATP NADH ミトコンドリア外! (サイトソル) ピルビン酸 CO2 アセチルCoAの産生: 糖、アミノ酸、脂質などが共通した小分子へと分解。クエン酸サイクル: アセチル CoAが酸化され、還元型補酵素が生産される。酸化的リン酸化: 還元型補酵素に伝達されたエネルギーにもとづき、ATPが合成される。ミトコンドリア内アセチルCoA NAD+ FAD クエン酸 サイクル CO2 酸化的 リン酸化 NADH FADH2 ミトコンドリア（1）好気的代謝の舞台：内膜、及び内膜で囲まれた空間(マトリックス)で行う。 好気代謝以外の役割：アミノ酸・鉄・脂質の代謝、カルシウム濃度の維持、アポトーシス誘導(シトクロムc放出による誘導)などの役割も持つ。外膜：ポリンという膜タンパクを介して分子量10,000以下程度の物質を透過できる。! 膜間部：サイトソルの物質がここまで浸透して来られる。! 内膜：膜タンパク質を多量に含む物質透過性の低い膜 (O2やCO2は透過)。好気的代謝に必要なタンパク質複合体や、物質輸送用タンパク質が埋まっている。! マトリックス：水分量が50%以下のゲル状空間。溶存酵素多数。ミトコンドリア固有の環状DNAも存在（ただし、ミトコンドリアタンパクの95%は核の染色体に存在。）実際は豆粒状の形態だけでなく、多様性に富む外膜マトリックス内膜膜間部透過電顕像クリステミトコンドリア模式図ミトコンドリア（2）クリステ：内膜が陥入してできたひだ状構造部。呼吸の状態に応じて、形態が大きく変化する。マウス肝ミトコンドリアの電顕写真。活発な状態（呼吸時）休止状態（通常）＊ミトコンドリアの数は細胞種によって異なるが、ヒトの体内で約20%の体積を占めると推定されている。ミトコンドリアにおけるピルビン酸酸化の概念図 28 ミトコンドリアマトリックスへの物質輸送内膜の物質透過性が低いため、原料や生成物をサイトソルとやりとりするためには、膜を介した物質輸送システムが必要。（内膜は、O2, CO2, H2Oのみを自由に通す。） 2+ 運ぶべき物質 - ATP/ADP, Pi(リン酸イオン), Ca ! - ピルビン酸、オキサロ酢酸、アセチルCoA! - サイトソルで生じるNADH! ! ! ! など。マトリックス ATP シンターゼ内膜 ADP/ATPトランスロケータ H+ ADP/ATPトランスロケータ基質が来ると向こう側に開くマトリッ膜間部! クス! (正) (負) ATP4– or ADP3– 膜間部ロケータ - ADP/ATPトランスロケータ! - リン酸トランスロガーゼ H+ H+ /ATP トランスロ ADP/ATPトランス ADP/ATP, リン酸イオンの輸送リン酸トリン酸トランスラゼリン酸トランスロカーゼロカーゼ H+ コンホメーション2 ATP4– or ADP3– コンホメーション1 ADP/ATPトランスロケータのX線構造解析基質結合部膜間部膜間部膜間部側から見た図中央の穴が正電荷(青)を持っており、 ATP/ADPを結合内膜マトリックス＊赤い着色が負の表面電荷、青い着色が正の表面電荷を表す。 30 クエン酸サイクル（TCAサイクル、Krebs回路）アセチルCoA生成後、全８ステップのサイクル。! →ピルビン酸を３つのCO2に変換して燃やす。! - オキサロ酢酸とアセチルCoAの反応から始まり、オキサロ酢酸が再生して終わる。! - 1サイクルで２つのCO2を生成するが、このCO2 はアセチル基由来ではない（オキサロ酢酸由来）。アセチル基由来の炭素は、オキサロ酢酸に残る。! - 準備段階として、ピルビン酸をCoAに結合させ、アセチルCoAを得るプロセスが必要。ピルビン酸 CO2 NADH アセチルCoA NADH + H+ クエン酸サイクル NADH CO2 FADH2 CO2 GTP NADH GDP + Pi + H+ + H+ ピルビン酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体（PDC）アセチルCoAの生成：ピルビン酸 + NAD+ + CoASH → アセチルCoA + NADH + CO2 + H+ ５つの連続反応により遂行される。実際には、３種の酵素の多量体である『ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体』により触媒される。 E1: ピルビン酸デヒドロゲナーゼ (脱炭酸)! E2: ジヒドロリポアミドS-アセチルトランスフェラーゼ (CoAと反応)! E3: ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ (E2の再生/NADH生産)! - 次の反応までの移動距離が抑えられ、連続反応に有利。! - 副反応が抑えられる。(競合反応の影響を受けにくい。)! - 反応の同調的制御に有利。 →３つの酵素が連動して触媒サイクルを回す。 PDCの触媒する5反応補酵素TPPとリポ酸が不可欠 E3 E1 E2 アセチル基を受け渡すピルビン酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体（PDC）の構造 E1: ピルビン酸デヒドロゲナーゼ (２量体で存在)! E2: ジヒドロリポアミドS-アセチルトランスフェラーゼ (３量体で存在)! E3: ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ (２量体で存在)! →合計60サブユニットの巨大複合体（大腸菌で。4.6 MDa, 直径~30 nm）大腸菌の例その他の菌! の例 E2３量体が立方 E1２量体が辺上に24個、体頂点に配置 E3２量体が面上に12個 (24個) ある種の菌ではさらに複合体は大きく(~10 MDa; 直径50 nm)、コアは正十二面体である。 E1とE3からなる外殻 E2からなる内殻! (正十二面体コア) 合計60サブユニットのキューブ E2 (ジヒドロリポアミドS-アセチルトランスフェラーゼ) の３量体構造ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（E1）の反応には補酵素が必要補酵素: チアミン二リン酸 (TPP) 酸性 プロトンアミノ! ピリジン環チアゾリウム環ピルビン酸ピロリン酸 H+ TPP (イリド型) TPP アルコール発酵ピルビン酸 デカルボキシラーゼ求核攻撃アセトアルデヒドすぐにE2上の別の補酵素と反応し、アセチル基を渡してE1が再生。 E1 E1 E1 ピルビン酸 CO2 CO2脱離デヒドロゲナーゼ (E1) –H+ +H+ ２炭素受け取りリポアミド–E2 S-アセチルジヒドロリポアミド–E2 共鳴安定化したカルボアニオン E2 (ジヒドロリポアミドS-アセチルトランスフェラーゼ)では補酵素を介してCoAと反応リポ酸（補酵素）を介した酸化還元反応リポ酸 Lys CoAの-SHとのエステル交換反応アセチルCoA 環状 ジスルフィド酸化型（リポアミド） 2H+ + e– S-アセチルジヒドロリポアミド–E2 ジチオール還元型（ジヒドロリポアミド）ジヒドロリポアミド– E2 E3(ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ)はE2の再生を担う E3がジヒドロリポアミドを酸化してE2を再生触媒サイクルへ (E1と接触) E3（酸化型） E3（還元型） E3は内蔵されたFADを使って、-SHを酸化 NAD+ NADH + H+ FAD S S 生じたFADH2はNAD+で酸化され再生。! (NAD+は、ピルビン酸を直接酸化するのではなく、酵素内のFADH2を酸化。) E3の酵素活性部位のX線結晶構造解析モデル中間体授受を可能にする秘訣∼E2の長くぶらぶらな腕 E2のリポアミドドメイン(リポイルドメイン)がE1にアセチル基を受け取りに行っている。ピルビン酸! リポイルドメインがE1, E3外殻と内殻の連続的に反応を進める。 CO2 E1 NAD+ アセチル CoA CoA E1とE3からなる外殻間を漂い、 E3 NADH E2からなる内殻リポイル リシル側鎖 PDC構造! のモデルリポイル ドメイン