一32一食物学会誌・第26号卵黄Vitellinに Vitellinよ関する研究(第2報) りホスホセリンの分離およびVitellin中ホスホセリン,セリン,プロリン,メ安 Studies Separation on the Vitellin チオニン含量について福 of 英 Yolk 言のアミノ酸含量の定量を行なっミノ酸自動分析器により50㎝カラムで中酸性ヒドリン反応(+),リ 2」スパラギン酸の前部にニンン反応(+)の1つのピークを認 Syoko 除去して,黒得た。これを蒸留水で溶解し,pH に定容し沖過する。その2m1を 3.0のHC1で充てんし,同HC ム1(2×15㎝)に acidを2N-HCIで処理して・ミリウム塩沈殿よりセリ試料を添加,同HCIで脂上部に褐色リングなるまで溶出する(樹が残存)。次に0.1N-HCIでみた。またVitellin中のリンがすべてセリンと結合し一で分取し,ニンヒドリンとリンの反応が(+)の部分,F. なりわれわれの得た結果よりかなりの差を生じる。し (褐色リング溶出)を集めたがって,ホ減圧濃縮を行ないHC1 は他のアミノ酸に比べて非常に分解されやすい性質のものであると考えられるので,ホスホセリンの定量法 C. No.12∼15 を除去した。このカラム 1処理後の分画試料をアについて検索し,理論値に近い値を得た。その他,外ミノ酸自動分析で分析しそう法より含量を算出していた,セてみると,図2一リン,プロリン, メチオニンについても再検討を行なつたので報告する。 II.実験の展開を行ない,59つつフラクションコレクタているとすれば理論上のホスホセリン含量は2,89とスホセリンの定量については6N-HCIで 1で充分洗浄後, 出液がニンヒドリン反応(一)にの分離を試ラ展開し,溶ンも,その%はの形では分離・定量されていないので,そ調整後20ml 膨潤した後,カンとリンの結合を証明しており,またカゼイン中のリリンとリン酸がエステル結合したホスホセリン 1.5に圧アルカ褐色粉末を次に述べるカラム展 400mesh)109をpH も卵黄からとり出したVitellenic セリンと結合していると報告している Kido 開の試料とした。精製したアンバライトIR-45(200∼ めた。Rapoportらが,セ子間加水分解を行なった後,減リデシケーター中でHCIを 1) アミノ酸を分析した時,ア詔 2) Yasufuku 通じながら4時た際,ア戸 of Phosphoserine and Contents of Phosphoserine, Serne, Prorine and Methionine in Vitellin 1.緒でVitellin中木子 (Part Hideko 第1報の ①のごとくホスホセリン以外に主として酸性アミノ酸で部あるアスパラギン酸,グ II-1実 II-1-I Vitellin 験方法 Vitellinよルタミン酸の小さなピーりボスホセリンの分離 19に6N--HCI *本学食品学研究室 100m1を加え,窒クが混在するのが認めら素ガスをれたので,さらにカラム IIを使用して精製を行な図1ホスホセリンの分離昭和4 6 年1 1月 ( 1 9 7 1 ) - 33果ホスホセリン部に 1つのピークを認めた。った。カラム Iと同様，アンパライト IR-4510gを p H 2 . 5 0cmカラムを使用した場なおアミノ酸自動分析器で、 5 の HCl膨潤したものをカラム 1 1に充てんし蒸留水合，ホスホセリンもホスホスレオニンもほとんど同位 H1 .5に調整で洗浄後，カラム I処理後の分画試料を p 置にピークを認めたので，次に述べるようにホスホセ H2.5の HCl で展開し，溶出液のした後吸着させ， p リン，ホスホスレオニンを対照として同定を行なった。 11-1-11 ホスセリンの同定ニンヒドリン反応が(ー〉になるまで溶出させる。カラ O.2N-HClで展開を行なし、，フラクションコレクター 1)酸加水分解標品のホスホセリン，ホスホスレオニンと分離したで5gづっ分取して，ニンヒドリン反応(+)，リン反応試料の混合試験をアミノ酸自分析器で分析したが，い (+)の部分， F .C . No.5，6を得，減圧濃縮して HCl ずれも 1つのピークしか得られなかった。またアミノを完全に除去して粘着褐色物質を得た。この分画物質酸により 570mμ と 440mμ の吸光度の比が異なるのでは図 2一⑧のごとくアミノ酸自動分析器で分析した結ホスホセリンとホスホスレオニンの吸光度比を比較検ム Iと同様褐色リングがカラム上部に残存する。次に討したが，あまり差がなかった。 4時間分後述のごとく， 6N-HCl でホスホセリンを 2 2 . 0 ① . 10 カラム IS 主主里解すればセリンに分解されることから， V i t c l l i n より J事 E43 000 川町説分離精製した粘着褐色物の一定量を 6N-HClで減圧 1 00Cで2 4時間分解を行なった後， HClを除封管し， 1 去しアミノ酸分析を行なった結果図 3 ①のように， 0 . 2 セリン部に 1つのピークを認めた。この酸分解液に標 0 . 1 3 0 6 0 ~O 1 2 0 日当向(帆同J ， 10 品のセリンおよびスレオニンを加え，混合試験を行な 1 8 0 った結果図 3一⑧⑧のようにセリンと一致した。 2) 薄層クロマトグラフィー 2 . 0 一般のアミノ酸についての薄層クロマトグラフィー 1 . 0 については多くの文献が見られるが，リン酸とエステ ②カラム宜主旦王聖，ル結合したものについては少なし、。標品のホスホセリ 0 . 制 0 4 ン，ホスホスレオニンおよびセリン，スレオニンを対ポ 0 . 3 割日照として，シリカゲル Gを用い蒸留水で吸着プレート 0 . 2 。 l を作り，種種の溶媒で展開したが，ホスホセリン，ホスホスレオニンは原点よりほとんど移動しない。そこ 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 I~O 尚南("""") ①試を混入して試みたが移動率が小さく， 1 0 ト⑧試料 + Ser. 料 0 .5 ' 1 . 0 0 . 5 0 .5 ' l ! < l 0 .4 - ~ 誠 0・3 説。3 * 0 . 3 ' l ! 0 . 2 ￨且Z 。￨ I 0 . 1 戸 I、ー一一一ーナ一白一 9 0 内向 (mi九) Mamgold らの卜⑧試料 +Thr. 0 4 - ~ 0 .4 - 丞リン化合物ではアルカリ吸着プレートを使用している場合が多いので，炭酸ナトリウムなどのアルカリ図 2 カラム処理後のホスホセリンクロマトグラフィー 1 . 0 で，時間(甘い札.) 。 9 D 前向 ( " " ' 1 1 .) 図3 V i t e l l i n の2 4日寺間目安分解のホスホセリンクロマトグラフィー 3 4ー一食物学会誌・第2 6 号 (Rfx1 0 0 ) 表 1 アミノ酸の薄層クロマトグラフィ開リカゲノレ展吸着プレート溶媒ノタ心メ・・・おム・・ /phU クルンモニウムレ，2 ホ( ロ水ロ: 10%硫酸液 96%アルコール:水 ( 7:1 ) プロパノール:ギ酸:水 ( 2 0:1:5 ) I 59 I 68 I 68 3 o I 1 5 5 5 5 1 5 I 8 1 J 2 I 31 96%アルコール:水 ( 7:1 ) 48 1 5 0 I 6 0 I 6 1 96%アルコール:水 ( 7:3 ) 5 0 1 5 4 I 6 0 1 6 2 FbAU FO り用したところ。表 1に示すような Rf値を得た。その同U F 10% 硫酸アンモニウムのシリカゲル吸着フ。レートを使 4唖 96%アルコール:水 ( 7:1 ) 8ιzn ワU F D 2 5:1 5:4:2 )I :酢酸:水 ( アンモニウム I 2 3 lクロロホルム:メタノーノレ￨ 1 %硫酸 3 4 レ， 1 ノ、jノ F タ /︻¥ .ff メ1 '/ 、ム、レアンモニウムホロロク 5 %硫酸 6 7 1 0 5 8 展開溶媒・温度・時間:96%アルコール:水 ( 7:3 )，室温， 2時間うち 5 %の硫酸アンモニウムでシリカゲル Gの吸着プ呈色:0.3gのニンヒドリンを 100mln ーブ、タノール 7:3 )の溶媒でレートを使用し， 96%アノレコール:水 ( と 3ml酢酸に溶解したものを噴霧し， 1 1 00Cで1 0分間展開したものが，ホスホセリン，ホスホスレオニンお加熱。よびセリン，スレオニンを対照として行なう場合，最も適していると考えられる。結果:試料( 1)Rf=0.50，試料(2)Rf=0.60 3) 炉紙電気泳動 V i t e 1 1 in より分離したホスセリンを試料( 1 ) そのホ V i t e l l i n より分離したホスホセリンを試料として水スホセリンの 2 4時間酸分解物を試料( 2 )とし下記のごと平，液体冷却高圧泳動装置を使用して，次に示す条件く薄展クロマトグラフィーによる同定を行なった。で行なった。硫酸アンモ吸着プレート:シリカゲル G30gに 5 % . 2 5 阻の吸着フ。レートを作エウム溶液 60mlを加え， 0 1 0Cで 1時間乾燥し， 3 0分以上放置したものを用り1 0 L、 T こ。 5:5:8 0 ( p Hl .9 ) 緩衝液:酢酸:ギ酸:水=1 炉紙:東洋炉紙 No.51(2x20 佃)，正極より 5佃の位置を原線とする。 0分泳動 :75vjcm，9 呈色:0.2%ニンヒドリン水飽和ブタノール溶液を •• •・ • t.I 5 r . . 2 . 3 4 - 4 5 • 6 o 噴霧し 1 0 0C， 5分加熱移動度:0 . 7佃なお，標品のホスホセリン，ホスホスレオニンを対表 2 アミノ酸の炉紙電気泳動の移動距離〈佃〉アミノ酸 p H1.9 75vjcm 9 0分房、占 2 . 試料( 2 ) 3 . P-Ser . . S p o t1 . 試料(1) 5 . S e r . 6 . T h r . 4 . P-Thr ・図 4 アミノ酸の薄層クロマトグラフィー試料 P . S e r . P.Thr. O .7 O .7 1 .9 昭和46 年1 1月 ( 1 9 7 1 ) 分解時間 e r . IP S e r .I S 1 6 4 h 4 1 1-1-1 1V i t el 1 in 中のホスセリンの定量 (μmo I j gV i t e l l i n ) ・ 9“ 丹、 usuτFapooo ，照として行ない表 2，図 5に示す結果を得た。アミノ酸の変化噌・尿点図 5 アミノの酸P紙電気泳動 i t e l l i n 中の酸分解による表4 V /乃 1111111 ↑﹁ 3311 i 誌料 - 35- . IPro. I恥1et 245 1 1 1 1 1 0 1 7 7 2 0 9 527 2 4 1 1 2 3 758 3 1 1 1 7 5 9 7 703 359 1 7 3 1 3 5 9 3 865 429 2 2 4 1 8 0 1) 標品のホスホセリン，ホスホスレオニンの酸分解による残存率 S e r . 佃カラムを使ホスホセリンもホスホスレオニンも 50 8 0 0 用したアミノ酸分析器によるクロマトグラムは，ほぼ同じ位置にピークを認める。そこで両者について 6N- HClを標品に対し 2 0 0倍量加え封管して1l00Cで分解し院。時間経過によるホスセリン，ホスホスレオニンの残存表 3 ホスホセリン，ホスホスレオニンの M t t 酸分解による残存率 P -$er (%) 2 P . S e r 分解時間 ( h r r . ) IP S e r Se r I P -Thr Thr 1 0 0 92.4 ， 414 O/21i 。 1 0 0 。 6 百 2 品 aZ P 0 0 0 円 400a i i 噌唱せ “ ヮ 41 .5 32.4 1 8 . 7 2 9 .7 47.6 5 . 9 1 .6 49.3 52.5 44.6 i t e l l i n中の酸分解によるアミノ酸の変化図7 V 率を検討し，表 3，図 6に示す結果を得た。 2) V i t e l l i n中のホスホセリンの弱酸および短時間 10.6 7 9 . 1 4 分織防向 ( h れ〉による分解 100.4 3 . 0 90.5 67.2 16.2 V i t el 1 in を 1N，2N，3N，4N-HCl で分解して定量し 21 .7 たがあまり回収率はよくなかった。そこで 6N-HClでホスホセリンは 6N-HCl では不安定なことから，第 7図のごとく， 8時間までの分解状態を検討し 4時間で最高値を得た。 0 以上の結果より V i t e l l i n 中のホスホセリンは， 6N- HClで 4時間加水分解を行なった定量値より V i t e l l i n 100g 中のアミノ酸残基に対する g数を算出すると (守、 JAυ 内晶U F b u u i :〉:J 2.6gとなっ T こ。 p -T . r r . I I-1-I I IV i t e l l i n中のセリン，プロリン，メチオニンの定量・ _ .s ホスホセリンの定量と同様， 6N-HClで 8時間までの分解による変化を検討し図 7のような結果を得， 8 P S . r 2 4 百 1 2 . 1 9 日寺向 (h r 〉守図 6 ホスホセリン，ホスホスレオニンの酸分解による残存率時間で最高値を得た。 2 4 - II-II実験結果および考察 ( l ) V it e l l i n よりホスホセリンをアンバライト IR-45 を使用し分離精製を行ない粘着褐色物を得，その性状をアミノ酸自動分析器や，薄層クロマトグラフィー， - 36- 食物学会誌・第2 6 号電気泳動により実験した結果，ホスホセリンであるこる。したがってセリンについては 8時間の値に補正をとを認めた。結品化を試みたが，微量成分である上に，加えた 8.4gとする方がよいのではないかと考える。セリンとリンが分離しやすく，結品化には至らなかっ i t e 他のアミノ酸については. 8時間の値をとれば， V た。 l l i n中のプロリン 4 . 2g，メチオニン 2.8gとなり，シ (の第 1報で、得たホスホセリンの含量が理論値とかなりの差を認めるのでホスホセリンの定量法についてスチンの場合も 8時間の値から算出すれば1.1gとなる。検討を行なった結果，表 3のようにホスホスレオニ i t e l l i n 中のアミノ以上の結果より第 1報で、得た V ンは 6N-HCl と加熱した場合， 8時間ではその残存酸含量を再検討することにより，第 1報のアミノ酸の率が67.2%と比較的安定なのに対し，ホスホセリンは中，ホスホセリンを 4時間の分析値に約 10%の補正を 18.7%となっていることから 6N-HCl で V i t e l l i nを加え， 2.8gとすると，全アミノ酸の回収率は 1 0 0 _1% 定量する場合，短時間によらなければならないことがとなる。さらにセリンを 8時間の値に 10%補正を加え， i t e l l i n中のホスホセリンは 4時間で最高値判明し， V 8.4gとすると 99.7%となり，シスチン，プロリン，を得，その結果ホスホセリン含量は 2.6gとなった。メチオニン含量を外そう法によらず 8時間の値をとれこの値は理論値 2.8gより低い値となるが，セリンとば9 9 .1%となり，よい回収率が得られた。同様ホスホセリンは酸と加熱することにより非常に分 1 11 . 要約解されやすいので， 10%増の補正を加えると， 2.86g となり理論{直に近い値が得られる。 ( l ) V i t e l l i n よりセリンとリンのエステル結合したホ ( 3 )ホスホセリンの他，第 1報で外そう法じよりアミスホセリンを分離した。ノ酸含量を算出したセリン，プロリン，メチオニンに ( 2 ) V i t e l l i n を短時間で酸分解することにより， 4時ついても， 6N-HCl で短時間による分解を検討してみ間の分解値に 10% 補正を加え，理論値に近いホスホセたが，いずれも 8時間の分析値の方が高いと考えられリン含量を得た。 ( 3 )セリン，プロリン，メチオニンについても短時間 l t e l l i n のアミノ酸組成表5 V (g!100gV l t e l l i n ) アミノ酔 -AQU hHQU ワワ臼 VA Q U S笠宮 U O V A 2599861422443329644 たんぱく質 1 0 0g 中アミノ￨酸残基に対する g数山いては 8時間の分解値に 10%補正した値をとる方がよいものと考える。またシチスン，メチオニンについは外そう法によらず 8時間の値をとる方がよいと考える。 i t e l l i nを酸分解時間による各ア以上のように卵黄 V ミノ酸含量をアミノ酸自動分析器により定量を行ない， V i t e l l i n のアミノ酸組成を検索し，表 5に示すように 9 9 " ' 1 0 0 %の回収率を得た。本研究に対し御指導，御配慮、をたまわりました本学噌 'A ••••...••.• 吐ワ白 A 吐 1A 伊 bqdpboOA 、、ノ 2 1 8、 BJ ノ、 4 12 〆t ¥ / S K / t ¥ & L t n 比比仁 y a q σ E h n ph仁 eLI HL r 仏-子み -yakee TLHAPATSGPGACVMHLTP 問￨による酸分解による変化を検討した結果，セリンにつ •• 名誉教授工藤豊先生に深謝します。参考文献 1 ) 安福，木戸，本誌， 2 6 .2 7( 1 9 7 1 ) 2 )S .Rapoport，BiochemZ .，2 8 9，4 2 0( 1 9 6 3 " ' 1 9 3 7 ) . Weissberger，Technigueo fO r 3 )E .S . Perry，A g a n i cChemistry，1 2，309，4 3 8( 19 6 7 ) 4 ) KurtRanderatb，Thin-LayerChromatography.， 1 1 0，1 5 9，1 7 0( 1 9 6 6 ) せ 5 )H .K. Mangold，R . Kammereck， J . Am. O i l A吐 ι C h e m i s t ' sS o c .，3 9，2 0 1( 19 6 2 ) 6 ) 電気泳動学会，電気泳動実験法， 1 7 5( 19 6 7 ) 合計 9 9 .7 ( 9 9 .1 ) ( )は 8時間酸分解値をとった場合