一一13一 Bi・assayに よ る 食 品 中 のMethi・nine・Thre・nineの 高 松 緒 定 量 dE 橋 本 信 mensenteroides 言 私達 日本 人 は 蛋 白 源 を 米 蛋 白 と大 豆 蛋 白 に 依 存 す る こ とが 多 く,特 に 大 豆 蛋 白 は質 的,量 的 に も優 れ た 蛋 ・1, Streptccocus 2) 沢 → ←→ ← 子 Threonine定 faecalisRを 量 に は, 使 用 した 。 保 存 培 地 の 調 製 と菌 株 の 保 存 白 栄 養 源 を な し て い る。 こ の大 豆 蛋 白 を 構 成 して い る 使 用菌 株 の 保 存 を 行 うた め に 日水 の 一 般 乳 酸菌 保 存 ア ミノ酸 値 を 明 らか に す る に は,簡 易 で 然 も信 頼 し得 用 培 地 に 炭 酸 カ ル シ ウ ムを 入 れ た もの を保 存 寒 天 培 養 る 精 度 の 高 い 測 定 法Bioassay即 基 と した 。 そ の 組 成 は 第 一 表 の 如 くで あ る 。 ち微 生 物 定 量 法 が 乳 酸 菌 保 存 培 地 成 分 組 成60g(1L分)中 あ り,こ の方 法 は 最 近 広 く生化 学 的 研 究 に 応 用 され る に 至 つた 。 分1分 成 微 生 物 定 量 法 は,微 生 物 の栄 養 要 求 を 基 礎 とし て ア ミノ酸 を 定 量 す る 方 法 で,定 量 し よ うとす る ア ミノ酸 を 特 異 的 に 要 求 す る 乳 酸菌 を選 ぶ の で,そ の原理 は 「 微 生 物 の増 殖 に 必 要 な す べ ての 栄 養 素 を 含 む 培 地 か ら 定 量 し よ うとす る ア ミ ノ酸 を 除 くと,そ れ を 合 成 しえ 副 成 到 分量 5,59 リ ン 酸 ニ カ リ ウ ム0,25 ペ フ トン 12,59 硫 酸 マ グ ネ シ ウ ムb,!g ブ ドウ 糖 11,09 硫醜 酵 母エ キス 0,258 リ ン酸 一 カ リ ウ ム 10,0g 酢 酸 ナ ト リウ ム ン ガ ン;5,0mg 硫 酸 第 一一鉄 5,0mg 粉末寒 天 20,0g な い 微 生 物 即 ち 特 異 的 に 要 求 す る菌 株 は増 殖 し な い 。 PH こ の 培 地 に 除 い た ア ミ ノ酸 を い ろ い ろ の 濃 度 に 加 えた 時,一 一定 濃 度 範 囲 で の 増 殖 度 が,加 えた ア ミノ酸 の濃 度 に 比 例 し,又 他 の ビ タ ミンや ア ミ ノ酸 が,必 要 以上 に あ つて も増 殖 が 影 響 され な い 時 は,増 殖 度 を は か つ て ア ミノ酸 の 定 量 が 出 来 る。 i) ア ミノ酸 の 微 生 物 定 量 法 の研 究 は,1943年kuiken 氏 等に よ り始 め られ,数 わ れ て 以 来,純 蛋 白,食 品,血 液,尿,汗 ル モ ン,酵 素,バ 代 謝 生 産 物,そ イ ラ ス,細 菌,細 背 髄 液,ホ 菌 毒 素,徽,植 物 の 他 生 物 に 関 す る物 質 中 の ア ミ ノ酸 の 定 量 が 報 告 され た 又1952年 田村,角 田,桐 村,宮 沢諸 2) 氏 に よ る乳 酸 菌 に よ る ア ミノ酸 定 量 法 が 報 告 され て い る 。 そ こ で 私 達 は3蛋 白 質Casein, (from Eggs)に 大 豆 及 び そ の 加 工 品,湯 高 野 豆 腐 な ど のmethionine,及 量 を 試 み た 。:methianineの mesenteroides faecalis Rを Gelatin P-60, Albumin 葉,醤 定 定 量 に はLeuconostoc は, Streptococus 使 用 した 。 菌 株 は 日水 製 薬 株 式 会 社 に よ り分 与 を 受 け た 。 こ れ らの 菌 は 合 成 培 地 に よ く 生 育 す る。 実 験 の 部 微 生 物 定 量 法 の準 備 及 び 操 作 1)使 間,間 分 注 し, Koch蒸 気 釜 に て5 歌 減 菌 後 保 存 し て お く。 菌 を 無 菌 箱 中 で 一 白 金 耳 接 種 し,32Qc24時 間 培 養 し 冷所 に 貯 え, 菌 株 の 植 え つ ぎ は__..間 毎 に 行 つた 。 前培 養培地 及び接 種菌 液 の調 製 定 量 操 作 の 場 合 は,前 述 の 保 存 菌 を 直接 接 種 す る わ けに はい か ず,保 存 菌 を 一 度 液 状 培 地 で 増 殖 す る 必 要 が あ る。 前 培 養 培 地 と し て は 日水 の一 般 乳 酸 菌 接 種 用 培 地 が あ る 。 そ の 組 成 は保 存 用 培 地 か ら寒 天 の み を 除 い た もの で あ る。 即 ち定 量 用 分 注 の3日 前,保 存 菌 を 無 菌 箱 中 で 液 状 培 地 に 移 殖 し 恒 温 器 で24時 間 培 養,こ 射 器 で 遠 沈 管 に と り,遠 心 分 離 に15分 間 か け 上 澄 液 を す て,0,9%Nacl水 り返 し,1:10の で 菌 体 を 洗 い,こ の 操 作 を2,3回 く 割 で 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し た もの を接 種 菌 液 と し た。 4)定 量用試 料の調 製 試 料 に はCasei11, tinの 三 蛋 白 質,及 腐,湯 葉,醤 Albumin(from eggs),Gela- び 大 豆 とそ の 加 工 品 で あ る高 野 豆 油 を使 用 した 先 ず 加 水 分 解 して遊 離 ア ミ ノ酸 液 と した 。 加 水 分 解 の 方 法 に は 酸 分 解,ア ル カ リ 用菌 株 分 解,酵 素 分 解 等 が あ るが 本 定 量 に は全 て 酸 分 解 を 行 一 般 に ア ミノ酸 の 定 量 に は 乳 酸 菌 が 使 用 され る 。 本 実 験 に お い でMethionine定 蔚 本学 助手 く とか し試 験 管 に10cc宛 分 間 宛3日 れ を2回 く り返 し,っ い で 液 状 培 地1ccを 煮 沸 済 み の 注 油, びthreonineの Threonineに 上 記 培 地 に 所 定 の 割 合 の 蒸 溜 水 を 加 え,湯 浴 中 で よ 3) 種 食 品 の ア ミ ノ酸 定 量 が 行 な 6,8土1 撒 本 学 副手 量 に は, Leuconostoc つた 。 各 試 料0,19を 正 確 に 秤 り10°oHCi 2ccを 加 え硝 子 ボ ンベ に 封 入 し120。c1(),時 間oil bath中 で分解 し た 。後 分 解 液 を蒸 溜 水 に て 洗 出 し,活 性 炭 を 少 量 加 え 一14一 食 物 学 会 誌 ・第13号 炉 過 し,熱 水 で 游 紙 附 着 物 を よ く洗 い,炉 液 と合 せ, 減 圧 に てHC1を 除 去 し10°o NaoHに てPH6,0に し た。 各 試 料 の 稀 釈 は 定 量 に 際 し てStandard 以 上 蒸 留 水 で100ccと 調製 Curve する。 上 記 試 薬 を 直 示 天 秤 で 正 確 に 秤 り,ア 難 溶 で あ るCystineとTyrosine=は に 挿 入 し てそ れ ぞ れ 含 有 γ数 を 求 め る 時 に 定 量 範 囲 に 加 え て と か し後 全 試 薬 を,よ 当 て は め られ る様 大 体 の 見 当 を つ け る た め 既 に 定 量 さ 6,4に 調 製 し た, れ て い る文 献 値 を 参 考 に 第 二 表 の 如 くに 稀 釈 し た 。 6) 第 試 料 二 矧M・thi・nin・ 1 趨 200倍 500倍 Gelatin ii 〃 Albumin 〃 // 大 豆 ii 200倍 高 野 豆 腐 〃 〃 湯 葉 〃 〃 醤 油 〃 〃 Casein 用 液 を20r/cc,40γ/ccに 7) 稀 釈 した 。 第4表 Methioni=ne標 レ 1 分到 9 ブ ドウ糖 定 量用培地 試 薬 1 4 分量 49 ア デ ニ ン硫 酸 塩 2mg 無 水 酢 酸 ナ ト リウ ム グ ア ニ ン塩 酸 塩 2mg K2HPo4 1,Qg uracil 2mg Thiamine 200r L-Proline 20mg Riboflavin 200r DL-Threonine 20mg Pantotenicacid 200r L-Lysine 40mg ピ リ ドキ ザ ー ル 40r L-Tryptophan 20mg パ ラ ァ ミノ安 息 香 酸 40r L-Serine ZOmg Glyccoll 20mg 200r Biotin 2r DレAlanine Folic 2r DL-Asparticacid acid 0,1 ・14・ 蒸 留 水 地 計(cc) 1 0.9 o,s 0,6 0.2 0.40.2 O 1 1 1 I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 212 2 0 16 a.1 0.2 0.4 1 水 地 1 1 Lの 1 1 2 2 計(cc) 0.9 o.s 0.6 0.2 24 3240 1・ 0.81.0 0 0.4!0.2 1 1 1 1 1 11 1 2 2 2 2 2 C2 2 の もの を3本 L-Cystine 20mg HCI-Histidine 20mg L-vali血e 20mg DレIsoleucine 40mg L-Methionine 20mg DL-leucine 20mg L-Phenylalanine 20mg 40mg 試 試 験管 番号 料 の 如 く分 注 し 試 料 検 液 8 0.25 Gelatin 検 9 液 10 系 11 0.5j1.O i a.25 列 12 13 o.5 1.0 Albumin 蒸 階 つ つ 分 注 し た, 第6表 Casein 29 8 14 200mg HCl 贈 輿:1牒 糠 2 200mg acid 10g 0 を 標 準 曲線 に 挿 入 出来 る 様0.25,0.5,1.Occの3段 L-Arginine ※ 塩 類 溶 液C 準 系列 4Qr/cc 培 1.oa 1 20r/cc 留 0.60,8 i 号o°o'・1234J67 各 ア ミ ノ酸 濃度 蒸 10.0 0.4b.8 0.2 第5表Threonine標 試験 甑 7 6.0…8.oi 前 述 の 標 準 系 列 を 第4表,第5表 L-Gutamic MnSO44H20 0 fi 200mg ZOmg ?VlgSO47HzO 3国5 2 ・1・0,5…12・ O 4cc 塩 類 溶 液C美 0,29 L-Tyrosine 5Y/cc 培 クェ ン酸 ナ ト リウ ム acid 各 ア ミノ酸 退 度 準 系列 lOr/cc 4) Nicotinic し た 。 第4表 の 羨 階 の も の 意 し た。 表 の 如 くで あ る。 薬 準 曲 線 作 成 用 の ア ミノ酸 を 測 定 誤 差 を 少 な くす るた め に 同 番 号 の もの を 三 本 用 基 礎 培地 を 要 時 第3表Hen・derson.-Snellの の原液 を 分注操作 溶 液 を 加 え 水 を 加 え て2ccと 調 製 し,常 に新 鮮 な もの を使 用 した 。 そ の 組 成 は 第3 試 液 を 作 成 し,こ 試 験 管 に 基 礎 培 地1cc,標 礎培 地の調製 本 実 験 で はHenderson-Snellの ll商を 稀 釈 し, L-Threonineは100r/cc原 試 験 管 番 号'001G 5)基 Hcl く と か し5°oHCIでpH 100γ/cc溶 5Y/cc,10i'/ccに 用IT竺e・nin・ 糧 、conc 標 準溶液 の作 成 L-Methianine 表 ミノ酸 の 中 で 14 15 16 0.25 0.511.O i 水 0.75 0.5 0 XO.75 0.5 00.75 Q.5 0 地 1 1 1 1 1 1i1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 留 培 計(cc) ■ 2 一15-一 昭 和38年1月(1963) 第7表 謙 17 葉 大 豆 醤 油 系 21 22 0.5 1.0' 列 23 24 0.2510.5 25 26 27128 1.0 0.25 0.75 地(cc) 計 20 0.25 蒸 留 水(cc) 培 19 液 0.2510.51.0 高野豆 腐 湯 18 検 (cc) 0.5 0 Q.75 0.5 0 1 1 1 1 1 1 2 12 2 2 2 0.5 1.O 0.5 a 1 1 1 12 2 2 0 0.7510.51 0.75 1 11 2 12 12 1 9 更に 試料の測 定 値が他 の要 素に 影響 され そい ないか,又 実 験の精度を確 か め るた め 各試 料の ア ミノ酸の回収 率 を2段階に つ き2本つつ 分注 した。 謙 29 30 ^ .25',0.5'x, 1 Casein Gelatin 第8表 回 収 31 33 32 34 油 鰍 留 培 39 40 41142 Q.5 0.25 !0.25 1 i 0.5 [α25[α5■ 1α25α5 鯉lq4α4iα41α4α4α 蒸 38 l 0.25 } 0.5 葉 醤 1 3637 35 i 0.5 高 野 豆 腐 豆 列 「 0.25. 大 系 i.0 Albumin 湯 用 水0.350.・ 地 α351α ゴ α4α4α41α4iα4-41α4 ・,0.35:0.・0.35'a.・: ・1・1・1・ … iO.350.110.35」0.110.35;0.・ 1・1・1・ い ・1・ ・ 計(cc)t212[212囹22国21212222 第10表 以 上 の 様 に 全 て 分 注 が 終 つた らア ル ミキ ヤ ブを か ぶ せ Koch蒸 8) 気 釜 で5分 問 減 菌 し急 冷 した 。 各ア 1滴 づ っ 接 種 し た 。(但 し0'番号 の も の は接 種 し な い) 接 種 が 終 つた ら37。c土1。c恒温 器 でThreonineは24 時 間,Methiollilleは40時 (r) 三 本の驚 騨 上 述 の 方 法 に よ つて 試 料 及 び 回収 率 を 測 定 し た 。 第11表 以 上 の 様 に し て 培 養 した もの を コ タ キ製AKA光 ィル タ 第9表 電 E3)で 繁 殖 度 を 比 濁 で 測 定 し た 。 ま ず 接 種 し て い な いConstantの 透 過 さ せ,標 液 に100%光 を 準 溶 液 の 比 濁 を 行 つた 結 果 Metihionine標 準系列 測定 結果 試 験 管 翻i・1・121345同7 各 ア ミt r>度1・1α5…i2i・ 三 本 の鴇 髄 率 ・21418iユ6「2413214・ 率f1 1…17516513giユ7回513 間 培 養 した 測定 及 び試料 の分析 比 色 計(フ 準系列 測定 結果 ・国2回45i6}7 試験 管番 号 接種 及び培 養 前 述 の接 種 菌 液 を 煮 沸 消 毒 済 の 注 射 器 で 無 菌 箱 中 で 9) Threonine標 ・14・ ・i 6・ ・0.8.10.0 1851695714212・ ・41gl 7 試 料100mg中 ＼ とミノ酸中 試料名＼ の ア ミノ酸 含 有 量 Threonine (mg) Methionine (mg) Casein 6.25 0.9 Gelatin 3.5 1.6 Albumin 7.4 3.44 高 野 豆 腐1 7.2 0.64 湯 葉 7.2 0.89 大 豆 7.6 0.7 醤 油 8.2 1.7 次に標 準 ア ミノ酸溶 液を 横軸 に透 過率 の値を縦軸 に 一16-一 食 物 学 会 誌 ・第13号 検 量 曲 線 を か き,検 液 に つ い て 得 た 透 過 率 を 挿 入 して 試 料 中 の 定 量 し よ う と す る メ チ オ ニ ン,ス 含 有 量 を 求 め る と 第11表 第1図 iVlethionine Response 第 旺 図Threonin Response 第 皿図 試料 の分析 第N図 試 料 の 分析 Methionine レオ ニ ンの の 結 果 が 得 られ た 。 Standard Dose curve Standard ThreOnine Dose curve 6γ :5.9γ=100°0:ズ タ6 κ% .・.3io 同 様 に し て 各 試 料 に つ き 計 算 し た 結 果(第12表,第13 表 の 如 くに な つた 。 又 回 収 率 を 出 す 為 に は 理 論 値 を100°oと し て計 算 す る・ 例 え ば ス レオ ニ ン定 量 の ゼ ラ チ ゾ0.5ccの 理 論 値 は2γ+41(検 液 系 列 の 値+4γ)で で あ る,従 つて 回収 率 を 求 め る と あ り,実 測 値 は5.9γ 一 一17-一 昭 和38年1月(1963) 第12表 Threonine平 要 均回収 率 [1] 実 測値 漣 論値 10.25cc 6.5i O. 5cc ; 9. Or Casein 回収率 1 O.5cc 6. Or よ り3蛋 白質Casein, Eggs) 5.9r Gelatin, 及 び 大 豆 とそ の 加工 品 高 野 Threonineの 含有 量 を 明 らか に した 。 900 0.25cc 5.07"j5. OY Gelatin Albumin(from 約 豆 腐,湯 葉 醤 油 のMethionine, 5.51'.,. 8.7γ Bioassayに 一 [2]定 100% 98.3°o 量 範 囲 と し て は,そ れぞれ の説が あるが 本 定fF?に はMethio算ine,10r, Threonine40r 以下 を I Albumin 0.25cc 8. or O. 5cc 10. J( ユ1.ar 9.7i そ の範 囲 と し た 。 - [3コ 92.3°0 回 収 率 に つ い て は 三 蛋 白 質,試 料 共100土10%0 程 度 の もの が 得 られ た 。 高 野豆 腐 0.25CC O. 湯 葉 l Z4.0γ 5cc 21. 0.25CC i 14.5i O. ;23.5; 5cc 112.or v [4]微 93°o 20.0γ 95°0 i13.9i 」」 104°o 2'T.Ol , 生 物 定 量 法 は 試 料 が 少量 で よ い事,又 微 生 物 を 使 用 す る の で,微 菌 株 の 選 択,培 反面 生 物 自身 の 条 件 の よ い 時 ・ 地 の 組 成,註PH/温 度 等 が ぴ った り一 致 した 好 条 件 の下 で 定 量 す る と精 度 の 高 い 定 量 値 を 得 __. 大 醤 豆 油 第13表 0.25cc 6.0;. O.5cc 16.5Y 0.25cc 18.5 32.or 32.0;' 32.0; ,0.5cc i Methionine平 103/0 s.2r ユ6γ 97° ° 均 回収 率 Casein 4.5Y 5.ar KA, 2) 田村 他 i 6.25r 6・ ・γil o.5CCi＆1γ 96°o s.or 葉 4}Micro iO 8)栄 養 と食 糧 大 豆 0.25cc i 4.75γ 0.5cc'6.9; 醤 油 1α25cc鼠1vsl O西CCi型5; 10)蛋 8.9ri101°o o.5CCI乳0γ17・0γ 1100% 「 4.7■98°0 6.5r 94% l 6.2-101% 8.5ri1・ E,ioassay 養 と 食 料 第6巻 1107% ・00 464 15,615 (1652) タ ミ ン,ア ミノ酸 の 微 ピ オ ア ツ セ イ 第1∼5,1954∼1956年 7)栄 5.9γ 献 Chem 彊 三 郎 著:ビ 930 o.5ccl5・5γ 8.8r 木 友 二,村 養 と食糧 4.9rit].02°0 .25cc 26 文 生 物定量 法。 9) 湯 農化 6)栄 α25ccl4.8γ 「 J, Biol 98.7jo' o.25cci s. sr ! s.or Q. 5cc 高野 豆 腐 KuiKen 考 乳 酸 菌 に よ る ア ミノ酸 定 量 法 3)鈴 5) 0.25cc Albumin 1) 111,°% O.5cc Gelatin で あ る。 参 100°o 犀 論値 実測値1回 収 率 0.25cc る こ とが 出 来 る 。 特 に 雑 菌 の 混 入 を 注 意 す る事 が 大 切 日産 研 究 所 編 白 質 化 学,赤 NO2, 第12巻 NO3 昭34∼35年 昭 和28年 第7巻 昭30年 微 生物 学的 定量法 堀 四 郎,水 島 三 一・ 郎編 集
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