様式(3) 琉球大学研究プロジェクト支援事業（若手研究者支援研究費）琉球大学学長岩政輝男殿所属部局・職分子生命科学研究センター・助教氏名徳田岳平成 19 年度研究プロジェクト支援事業(若手研究者支援研究費)研究実績報告書このことについて、以下のとおり報告いたします。 ➀研究課題シロアリ共生微生物の欠落および水平伝搬の可能性に関する研究シロアリ類は消化管内に棲息する微生物と相利共生関係を築いている。シロアリ消化管内における原核生物相の成立要因は不明な点が多く、外来菌種が定着する可能性も残さ ➁研究の概要れている。原核生物相はシロアリの消化生理に深く関与していることから、将来的にシロアリ類の原核生物相をコントロールできれば、ペストマネージメントの観点からも応用的価値が高い。そこで本研究では検出が容易なコウシュンシロアリ・メタン菌共生系をモデルとして、共生微生物の動態・欠落・水平伝搬の可能性について研究を行う。 ➂研究成果の概要本研究では、最初にコウシュンシロアリのメタン産生古細菌（メタン菌）検出方法の確立を試みた。研究計画に沿って、蛍光顕微鏡ならびにＰＣＲ法による検出系を検討した。蛍光顕微鏡観察では、シロアリ消化管内容物を等張液（Solution U）に懸濁し、ＢＶフィルター下で F420 の自家蛍光を検鏡した（図１）。その結果、自由生活型、腸壁付着型、原生生物共生型の 3 つの生活様式に分類することができた。自由生活型のメタン菌は稀で、ほとんどのメタン菌は腸壁に付着するか、または原生生物と一緒に確認された。このうち原生生物に関しては、コウシュンシロアリ消化管内に存在する 5 属 9 種の原生生物のうち、 4 種の原生生物（ Oxymonas, Foania, Trichomitopsis, Devescovina 属の原生生物）でメタン菌の分布が認められた。また、メタン菌は原生生物の細胞内よりも、主に細胞表面に付着していることが認められた。また、メタン菌が全く確認されないシロアリのコロニーも存在した。ＰＣＲ用テンプレートは、擬職アリ 1 個体の消化管から調整した図１ a：位相差顕微鏡像, b: DAPI 染色像, c：蛍光像（メタン生成菌の F420 による緑色自家蛍光像） DNA を用いた。ＰＣＲは古細菌のユニバーサルプライマーを用いて行ったが増幅が悪かったため、全てのサンプルで Methanobacteriales 用のコンセンサスプライマーを用いて nestedＰＣＲを行った。その結果、予想された位置にバンドの増幅が見られた個体と、全く増幅の認められない個体とが認められた。西表島で採集されたコロニーの個体についてこれらの方法を組み合わせてメタン菌の有無を検討した結果、両者の結果は一致していた。また、沖縄島を含めたその他の地域において採集された個体について、いずれかの方法でメタン菌の検出を試みたところ、採集場所によらず一定の割合でメタン菌が検出されなかった。シロアリ類は有翅虫への脱皮の際に腸内共生微生物を失う可能性があり、有翅虫のステージにおけるメタン菌保有の有無を PCR によるメタン菌検出法によって調べた。その結果、コウシュンシロアリにおいては、このことを示唆するデータが得られた。また、コウシュンシロアリのメタン菌非保有コロニーがメタン菌を再獲得する可能性を検証したところ、ある一定の割合で個体間においてメタン菌を受け渡すことが推定された。メタン菌の有無が宿主であるコウシュンシロアリに及ぼす影響を評価ため、野外採集コロニーを用いて頭部サイズの計測と体重の測定を行った。しかしながらコロニー間のばらつきが大きく、メタン菌保有コロニー非保有コロニーの差を検出することができなかった。これらのことから現時点では，メタン菌の有無が宿主に及ぼす影響が全くないと断言することはできないが，影響が軽微である可能性は高い。少なくともコロニー創設の成否や適応度に決定的な影響を及ぼすとは考えがたい。こうした結果からはシロアリ腸内ではメタン菌の代謝による影響は宿主にとって問題にならないほど小さいか，メタン菌が本来腸内で果たしている役割を補うことのできる共生微生物が他に腸内に存在するなどの可能性が考えられる。本研究においてメタン菌が宿主に与える影響の大きさについては明らかにならなかったものの、シロアリはその生活史の中で欠失や再獲得を繰り返していることが強く示唆された。シロアリ類とメタン菌との共生関係の維持機構にはさらなる研究が必要であると考えられた。 ➃研究成果の公表、あるいはその準備状況今後、学会等で研究結果を公表していくことを考えている。また、論文発表のためには追加データが必要であり、今後継続的にデータを収集し、論文発表に繋げたいと考えている。 ➄科学研究費等の申請に向けた準備状況本研究は 1 月開始であったことから、本研究から得られたアイデアなどに基づいて、すでに平成 21 年度科学研究費補助金（挑戦的萌芽研究）に応募中である。 ➅今後の研究の展開、展望シロアリ類とメタン菌との共生関係は必須であると考えられてきたが、本研究では、コウシュンシロアリにおいて共生メタンの欠失や再獲得が起きていることが強く示唆された。しかしながら、このことがシロアリの代謝系に与える影響や何に起因して起きているかは、明らかでない点が多い。したがって、今後シロアリ個体間（メタン菌保有個体や非保有個体間）で直接消化管内代謝物の比較ができる系を作出することが研究上大変重要であることに思い至り、上述の科研費申請に結びついている。この研究計画は微生物代謝物のみならず、すべての代謝物を二次元 NMR によって解析することでシロアリ代謝系の詳細を明らかにすることを意図しており、シロアリ消化管内におけるリグノセルロース消化系の再構築やカースト分化と微生物共生系との関わりについても重要な手掛かりを与えてくれることが期待される。＊上記について、概ね４ページ程度にまとめること。また、別途関連する資料類（論文別刷など）があれば添付すること。 ⑤費目別収支決算表合計実支出額の使用内訳物品費円 1,299,919 旅費円 850,654 謝金等円 68,320 その他円 0 円 380,945 （機械修理）交付申請書に記載の補助金の使用内訳円 1,300,000 円 800,000 円 350,000 円 100,000 円 50,000