色素性乾皮症(XP)由来細胞の紫外線感受性と遺伝子解析 UV Sensitivity and Genetic Analysis of Cells Derivedfrom Xeroderma Pigmentosum 奥井登代館延忠* 大山徹 Toyo Okui, Nobusada Tachiand Tohru Ohyama 色素乾皮症(Xeroderma Pigmentosum以下XPと略す)は常染色体劣性遺伝によるヒト遺伝病であり､臨床症した｡ XP11SAの37%致死量は正常細胞の約1 /10であること状としては日光露出部位の紅斑や水泡形成などの急性皮膚が認められ､紫外線に対して非常に高い感受性を示した｡炎症状､皮膚の乾燥､角化､色素沈着や脱色などが認めらまた､紫外線照射後の不定期DNA合成は5 %以下で､ほれる｡さらに､これらの皮膚病変部位に正常人の約2000倍の高頻度で皮膚癌が発生する｡また､他臓器の痛も正常人の10∼20倍高頻度に発生する｡これらの症状に加えて､知能低下などの神経症状が合併する場合もある｡ XP患者の細胞は紫外線誘発除去修復能が欠損していることにより紫外線に対して高い感受性を示すことが明らかになっている｡また､細胞融合による遺伝的相補性テストによってA-G の8群と紫外線照射後の複製後修復能が欠損しているバリアントの8つの遺伝的相補性群の存在が知られている1-2)｡皮膚症状や神経症状の重症度は相補性群により違いがあり､原因遺伝子が異なること､さらに同一群の患者でも遺伝子の変異の箇所により症状の程度の差があることなどが遺伝子レベルの研究から明らかになってきた3-9)｡今回我々は､札幌医大でXPと診断された患者 (XP11SA)の紫外線感受性とDNA除去修復能を調べた｡また､この患者と併せて､過去に紫外線感受性を調べた XP患者(XP6SA､ XP1AS､ XP12SA)10)の遺伝子解析も行った｡紫外線感受性試験および遺伝子解析には患者の皮膚由来線維芽細胞を使用した｡対照として正常人の皮膚由来線維芽細胞を用いた｡培養は10%の牛胎仔血清を含むMEM培養液を使用し､ 5%CO2培養器中で行った｡一定数の細胞をシャーレに播種し､紫外線照射後のコロニー形成率を得るコロニー形成法を用いて紫外線感受性を調べた11)｡細胞のDNA除去修復能の判定には紫外線照射後の3H-チミジンの取り込みをオートラジオグラフィーによって判定する不定期DNA合成(UDS)の検出法を用いた11)｡ XP11SAの紫外線感受性とUDSの結果をFig. 1に示 Fig. 1 (a) Lethal Effect of UV-irradiation on XP11SA *札幌医科大学医学部 (b)The Induction of UDS in XP11SA とんど認められなかった｡臨床症状とこれらの結果から､この患者はXPA群であると考えられた｡さらに詳細な判定を得るために遺伝子解析を行った｡についても遺伝子解析を行った｡正常人､ XP11SA､ XP6SAおよびXP1ASは培養線維芽細胞から､ XP12SAでは神経組織からDNA摘出キ XPA群の原因遺伝子は田中3)らによって見い出され､ット(和光)を用いてDNAを抽出した後､ Satokataらの XPAC遺伝子と名付けられた｡日本の大部分の患者は報告9)に従い下記のプライマーを用いて､エキソン4､エ XPAC遺伝子のイントロン3のスプライシング受容部位キソン6およびエキソン3を増幅した｡､のAGがACにG-Cトランスバージョンして､スプラ 41 5-gggaattcTTGCTGGGCTATTTGCAAAC-3(イントロン3) イシング異常が起こっていることが報告されている｡また､ 42 5-gggaattcGCCAAACCAATTATGACTAG-3 (イントロン4) A群の患者のうち､臨床症状がやや軽く､発癌年令も高 51 5-gggaattcCATTCTTTGGTACCTTTGGA-3(イントロン5) い患者からXPAC遺伝子のエキソン6のコドン228のC- 52 5-gggaattcGTAAAACACAATCCTTCACG-3(イントロン6) Tの変異､あるいはエキソン3のコドン116のT-Aの変 31 5-gggaattcGAAACTAGAGTTCATTTTCC-3(イントロン2) 異が検出されており､ XPA群の中でも遺伝子の異常の箇 32 5-gggaattcGTTTTGCCCTAAACCTACAC-3 (イントロン3) 所と臨床症状に関連があることが明らかになっている9)｡今回､札幌医大から提供されたXPA群患者(XP11 これらのPCR産物をそれぞれ制限酵素AlwN1 ､ Hph 1およびTru91を用いて制限酵素断片長多型(RFLP) SA)､すでに死亡したXP患者(XP12SA)および以前の検出を行った｡その結果､ XP6SA､ XP11SAおよびに紫外線感受性を調べた患者(XP6SA)の細胞DNA XP12SAではAlwN1で消化後G-Cトランスバージョを抽出し､遺伝子解析を行った｡また､細胞致死では高いンによって切断が生じ､ 328bpと244bpおよび84bpのバ紫外線感受性を示したが､ UDSが正常細胞の約20%認めらンドが見られた｡しかし､ Hph1とTru91による消化はれたことからXPC群が疑われた患者の細胞(XP1AS)10) 正常細胞と同様のバンドが得られた(Fig.2, Fig.3)c Fig.2 (a) Pedigree ofXP Analyzed byAlwN1 in Amplified DNAs (b) Diagram of the Position of the PCR Primers for Alw N 1 RFLP Analysis and the Location ofthe New Alw N 1 Site Generated by the Nucleotide Transversion Fig. 3 (a) Pedigree ofXPAnalyzed by Hph1 and Tru91 in Amplified DNAs (b) Diagram of the Position of the PCR Primers for Hph1 and Tru91 Site Generated by the Nucleotide Transversion Fig. 4 Sequence of XPAC Gene Fragments ofXP Patients また､ XP11SA､ XP1ASおよびXP12SAについて定試験には1か月以上要していた｡ PCR-RFLPやダイレはPCR産物のダイターミネーション法を用いたシークエクトシークエンシングなどの遺伝子診断は少量の血液や細ンシングを行った｡その結果､ XP11SAとXP12SAで胞模本で迅速にしかも遺伝子の異常の箇所を特定できるたはイントロン3のスプライシング受容部のG→Cトランめ､的確な治療方針の決定に貢献すると考えられる｡スバージョンが確認されたが､エキソン6のコドン228お文献よびエキソン3のコドン116には変異は認められなかった｡ XP1ASでは変異は認められず､正常細胞と同じであっ 1) Cleaver, J. E. : Nature, 218, 652 (1968) た(Fig.4)｡ 2) Friedberg, E. C.: DNA Repair, Freeman, New これらの結果により､ XP6SA, XP11SAおよびXP York (1984) p.505 12SAが日本で85%を占めているAlwN1 -/-タイプであ 3) Tanaka, K. etal. : Nature,348, 73 (1990) ることが明らかになった｡また細胞実験でC群を疑われ 4) Weed, G. etal. : Cell,62,777 (1990) たXP1ASは正常細胞と同様､ AlwN1 +/+､ Hph1+/ 5) Legerski, R. et al. : Nature, 359,70 (1992) +､およびTru91A+/+を示し､ A群ではないことが遺 6) Scherly, D. et al. : Nature, 363, 182 (1993) 伝子解析からも認められた｡ XP6SAの患者は受診当初､臨床症状が軽く､ XPA群ではないと推定されたが､当時はまだ遺伝子診断法が確立していなかったため､細胞培養を行い､紫外線感受性試験 7) D'Donovan, A. etal. : Nature, 363, 185 (1993) 8) Nishigori, C. etal. : Arch. Dermato. 1, 130, 191 (1994) 9) Satokata, I. etal. : Mut. Res., 273, 193 (1992) および相補性試験によって典型的なXPA群であると診断 10)奥井登代:道衛研所報, 40, 94 (1990) された例である｡しかし､これらの細胞学的試験による判 11) Okui, T. etal : Mutat. Res., 172,69 (1986)