Ｌ型菌３種６株の高温培養における増殖能とＨＳＰ６０産生量の関連について本実験の背景：Spirosomeのペリプラズム局在を調べる過程で、ＨＳＰ６０のペリプラズム局在が示唆された大腸菌スフェロプラストを1.75％ NaCl液に懸濁し、攪拌した前後の菌体と攪拌上清中の蛋白を調べた。 A 946743- １２３ B 94 67 ３ A, １．撹拌前のスフェロプラスト菌体２．撹拌後のスフェロプラスト菌体３．上清成分。 Spirosome 43 60kDa蛋白 B, 攪拌後の上清成分（A,３） 30- 抗HSP60によるウエスタンブロッティング抗HSP60抗体 Ab2(Clone LK2) #MS-263-P1ABX (LVC, USA) ペリプラズム蛋白の局在を調べるために L 型菌を用いた HSP60がペリプラズム局在ならL型菌ではどうなっているのか野生型と L型菌の全菌体成分の比較(35℃､8時間培養）１２ E.coli の安定型 L型菌（ＥｃＬ株） kDa 9467- １ E.coli B （全菌体）２ E.coli L型菌（全菌体）矢印 spirosome蛋白 43- 30- 矢印 60 kDa 蛋白 35℃ 培養のL型菌 EcL株には spirosome蛋白と60 kDaに相当するバンドがなかった 45℃培養のL型菌ではHSP60が増加するか 45℃培養におけるＬ型菌(ＥｃＬ株）のHSP60 A 1 2 3 B 1 2 3 A, SDS-PAGE １．野生型(E.coli B)全菌体 kDa 94 94 ２．安定型Ｌ型菌全菌体 67 67 ３． L型菌の培養上清 43 43 B, 抗HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング。１．野生型 30 30 ２．安定型Ｌ型菌３． L型菌の培養上清矢印 60kDa蛋白 45℃培養のＬ型菌にもHSP60のバンドは見られなかった。 (L型菌はHSP60を産生せずに45℃で増殖できた) 大腸菌非安定型L型菌 NC7 株の６０ｋDa蛋白と HSP60産生の確認(４０℃培養）抗HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング１２ kDa ３１２３１ E.coli K-12 （野生型）２ NC7株（非安定型L型菌）３ EcL株 (安定型L型菌）（３株とも40℃培養） 67- 矢印６０KDa HSP60蛋白 SDS－PAGE ウエスタンブロッティング大腸菌非安定型Ｌ型菌 NC7株は45℃では増殖できなかった。 40℃ 培養では６０ｋDa蛋白を産生し、HSP６０と確認された。化膿レンサ球菌Ｌ型菌１２４L株とL-C株の45℃増殖能とHSP60産生量 (45℃、40℃､培養）抗HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング１２２３ kDa １１２４ P 株（野生型） 40℃培養 67- ２１２４ L 株（ L型菌） 40℃培養３ L-C株（ L型菌） 124P 124L 124L L-C 45℃培養 L型菌１２４ L株は45℃で増殖せず、40℃で増殖した菌でもHSP60 の産生は極めて少なかった(野生型の親株は産生した）Ｌ型菌 L-C株は45℃で増殖し、HSP60も産生した黄色ブドウ球菌Ｌ型菌２０９PL株とSaL株の45℃増殖能とHSP60産生量 (35℃、40℃､培養）抗HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング kDa 67- １２３４１２０９PL株 35℃培養２２０９PL株 40℃培養３ SaL株 35℃培養 4 40℃培養 SaL株 L型菌２０９PL株とSaL株は45℃では増殖しなかった。 40℃で増殖した２０９PL株とSaL株ではHSP60の産生が見られた。Ｌ型菌の45℃での増殖能とＨＳＰ60の産生 45℃での増殖大腸菌化膿レンサ球菌黄色ブドウ球菌ＨＳＰ60の産生ＥｃＬ＋－ＮＣ7 － (40℃では+ ）＋Ｌ－Ｃ＋＋１２４Ｌ－ (40℃では+ ）－２０９PL － (40℃では+ ）＋ SaL － (40℃では+ ）＋ (NC7、124L、209PL、SaLのHSP60は40℃での産生を示す） L型菌のHSP60産生量は45℃増殖能とは必ずしも相関しない（HSP60は熱ショックストレスに直接には関連していない ?）大腸菌 L 型菌ＥｃＬ株とＮＣ 7 株の形質の違い小型球形 45℃で大型化するが球形ＥｃＬ株親株に復帰できない安定型 HSP60 －１０μm ＮＣ7株細胞壁を作り親株に復帰できる非安定型 HSP60 + 大型不定形親株に復帰親株に復帰できない安定型Ｌ型菌になるとHSP60を産生しなくなる？ NATURE Vol 392 1998 まとめ１．２菌種２株のL型菌で45℃での良好な増殖が見られ高い耐熱性を保持している事を確認した。２．２菌種２株のL型菌は40～45℃で増殖したにも関わらず、 HSP60がほとんど産生されず、本蛋白が熱ショックストレスとは関連していない可能性が示唆された。３．他のL型菌は40℃培養でHSP60 を産生し、L型菌にはHSP ６０産生株と非産生株がある事が分かった。４．細菌HSP６０の局在はペリプラズムの可能性があり、HSP６０を産生する L 型菌の病原作用は野生型とは異なる可能性がある。