大腸菌 HSP６０のペリプラズム局在の可能性と熱ショック対応機能について ① 【目的】我々は、食塩溶液中でスフェロプラストを破砕させずに攪拌しペリプラズム蛋白を分離する方法等で、大腸菌spirosomeのペリプラズム局在を示唆した（第78,80回本学会総会）。この方法を用いるとspirosome 蛋白と共に60kDaの蛋白が検出された。分子量等からHSP60の可能性が考えられ確認を試みた。大腸菌の HSP60は細胞質内局在と考えられているが、近年、別の菌種では細胞表面や培養液からも検出され、その意義が論議されている。今回、大腸菌HSP60のペリプラズム局在の可能性と、その機能について考察した。（前回） Spirosomeの局在を調べる目的で ② 細胞膜を壊さずペリプラズムの蛋白を分離することを試みたリゾチーム液で処理した菌体を３％ NaCl 液に懸濁し、攪拌処理によりペリプラズム蛋白を外液に遊離させる細胞壁ペリプラズム細胞膜細胞質内 ③ （今回）同じ方法で60kDa蛋白の産生を調べた【方法】リゾチーム処理したE. coli Bのスフェロプラストを1.75～3%食塩溶液に懸濁し、30秒間撹拌後、攪拌前後のスフェロプラストと遠心上清中の 60kDa 蛋白をSDSPAGEと抗HSP60抗体(LVC社製) を用いた Western blottingで解析した。更に HSP60のペリプラズム局在と機能を考察するため、大腸菌安定型Ｌ型菌と非安定型Ｌ型菌における60kDa蛋白の産生と 40～45℃培養でのHSP60の発現を調べた。 Absorbance(A600 ) 【方法】 ④ NaCl １．７５～３％の溶液中で攪拌しても大部分のスフェロプラストは壊れない 1 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 更に１００００回転３０分遠心 Concentration of NaCl(%) リゾチームで作成したスフェロプラスト NaCl溶液中で 30秒間攪拌３０００回転試料１５分遠心 ③攪拌後上清試料試料 ①攪拌前スフェロプラスト ②攪拌後スフェロプラスト【結果】 ⑤ 大腸菌スフェロプラストを1.75％ NaCl液に懸濁し、攪拌した前後の蛋白の比較１２３１．試料① 撹拌前のスフェロプラスト菌体 kDa ２．試料② 撹拌後のスフェロプラスト菌体３．試料③ 攪拌後上清成分。 9467- Spirosome 43- 60kDa 60kDa蛋白は、攪拌後の菌体には見られず、攪拌後の上清に検出された。 30SDS－PAGE E.coli B 30℃と45℃培養（PYG培地静置培養）による60kDa 蛋白の発現 1 2 1 30℃ 培養 94 2 45℃ 培養 67 矢印 60kDa蛋白 43 60kDa蛋白は、30℃培養に比較して45℃培養で著しく増加した 30 SDS－PAGE ⑥ 大腸菌スフェロプラストのNaCl液攪拌上清に見られた 60ｋDa 蛋白の抗 HSP60モノクローナル抗体による確認（ウエスタンブロッティング解析） A １２３ kDa B ３ kDa 94 94- 67 67- A, １．撹拌前のスフェロプラスト菌体２．撹拌後のスフェロプラスト菌体３．上清成分。 B, 43 43- 攪拌後の上清成分（A,３）のウエスタンブロッティング。 30- 矢印 60kDa蛋白 SDS－PAGE ウエスタンブロッティング上清中の60kDa蛋白は、HSP６０と確認された。 ⑦ 大腸菌スフェロプラストのNaCl液攪拌上清を、1万回転30分遠心し、上清をさらに4万回転､2時間遠心した沈査の電子顕微鏡像矢印はHSP60像、スケールは100ｎｍ ⑧ ⑨ 本法で精製（分別遠心）した60kDa蛋白の電子顕微鏡像（ネガティブ染色） Viitnen P.V,et.al. 1992 J.B.C. 文献と同様のHSP６０の形態が観察された 60kDa蛋白がペリプラズム局在ならL型菌ではどうなっているのか ⑩ 大腸菌野生型と安定型 L型菌（EcL株）の全菌体成分の比較 (35℃､8時間培養）１２ kDa 94- １ E.coli B （全菌体）２ E.coli L型菌EcL株（全菌体） spirosome蛋白 67- 60 kDa 蛋白 43- 35℃ 培養の安定型 L型菌 EcL株には spirosome蛋白と60 kDaに相当するバンドがなかった 30- SDS－PAGE 45℃培養では６０kDa蛋白が増加するか？ 45℃培養における安定型Ｌ型菌(ＥｃＬ株）の６０kDa蛋白とHSP６０の確認 A 1 2 3 B 1 2 3 ⑪ A, SDS-PAGE １．野生型(E.coli B)全菌体 kDa 94 94 67 67 43 43 ２．安定型Ｌ型菌全菌体３．安定型Ｌ型菌培養上清 B, 抗HSP60モノクローナル抗体(LABVISION #MS-263-P1ABX USA)によるウエスタンブロッティング。１．野生型 30 30 ２．安定型Ｌ型菌３．安定型Ｌ型菌培養上清 SDS－PAGE ウエスタンブロッティング矢印 60kDa蛋白 45℃培養のＬ型菌にも６０kDaのバンドは見られず、HSP60産生の確認もできなかった。 (安定型L型菌 EcL株はHSP60を産生せずに45℃で増殖できた) 大腸菌の野生型と安定型L型菌 EcL株における HSP60の発現 1 2 3 4 5 1 E.coli B株 37℃培養全菌体 kDa 2 E.coli B株 45℃培養全菌体 67- ポンソーS染色 67- 3 E.coli L型菌EcL株 37℃培養全菌体 4 E.coli L型菌EcL株 45℃培養全菌体 5 E.coli L型菌EcL株ウエスタンブロッティング 45℃培養の培地安定型 L型菌EcL株は45℃で増殖できる。しかしHSP60は発現していない。 ⑫ 大腸菌非安定型L型菌 NC7 株の６０ｋDa蛋白と HSP60産生の確認 ⑬ 抗HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング１２ kDa ３１２３１ E.coli K-12 （野生型）２ NC7株（非安定型L型菌）３ EcL株 (安定型L型菌） 67- （３株とも40℃培養）矢印６０KDa HSP60蛋白 SDS－PAGE ウエスタンブロッティング大腸菌非安定型Ｌ型菌 NC7株は40℃ 培養で６０ｋDa蛋白を産生し、HSP６０と確認された。しかし45℃では増殖できなかった。大腸菌Ｌ型菌２株の45℃での増殖能と HSP60の産生 45℃での増殖 HSP60の産生安定型ＥｃＬ株 + －非安定型ＮＣ7株ー + (NC7のHSP60は40℃での産生を示す） L型菌のHSP60産生量は45℃増殖能とは必ずしも相関しない（HSP60は熱ショックストレスに直接には関連していない?） ⑭ ⑮ 大腸菌L型菌ＥｃＬ株とＮＣ7株の形質の違い－ＥｃＬ株 HSP60 親株に復帰できない Spirosome －１０μm ＮＣ7株細胞壁を作り親株に復帰できる 45℃培養で大型化 HSP60 + Spirosome + 低塩濃度培養で親株に復帰親株に復帰できない(細胞壁を作れない）安定型Ｌ型菌は HSP60を産生しない（？） ⑯ 【結果と考察】大腸菌スフェロプラストを1.75～３％食塩溶液中で撹拌すると、Spirosome蛋白と60kDa蛋白が上清中に検出された。ほとんどの菌体は破砕されておらず、また攪拌後の菌体でこれらの蛋白が減少していることから、この二つの蛋白は細胞膜表面にゆるく結合していたと考えられ、ペリプラズムでの局在が示唆された。この 60kDa蛋白は45℃培養で増加し、抗HSP60抗体と反応した事から HSP60と考えられた。安定型Ｌ型菌のEcL株は45℃で増殖したが抗HSP60抗体と反応する60kDa蛋白は検出されず、一方、非安定型NC7株は45℃で増殖しなかったが40℃培養で 60kDa蛋白が検出された。これらの結果から、細菌の HSP60 は熱ショックに対応する本質的なものではないと考えられた。Mclennan N.らは大腸菌HSP60が細胞壁合成に必須であると報告しており（Nature 1998）、今回の結果も細菌におけるHSP60が耐熱性よりも細胞壁合成と関連する事を示しているものと思われる。まとめ１．大腸菌のスフェロプラストを１．７５％NaCl液中で攪拌すると60kDa蛋白は細胞質分画より攪拌上清の方により多く見られ、ペリプラズム局在（または菌体表面）が示唆された。２．この60KDa蛋白は抗HSP６０モノクローナル抗体によってHSP６０であることが確認された。３．大腸菌の安定型L型菌EcL株はHSP60を産生していないが45℃で増殖した。一方、非安定型NC7株ではHSP60を産生しているが45℃で増殖しなかった。４．大腸菌のHSP６０がペリプラズム（または菌体表面）に局在し、耐熱性より細胞壁合成に関与している可能性が示唆された。 ⑰ 参考文献 ⑱ NATURE Vol 392 1998