大腸菌における HSP６０のペリプラズムまたは菌体表層局在についてＳｐｉｒｏｓｏｍｅはペリプラズムにあると想定して実験１ｓｐｉｒｏｓｏｍｅがペリプラズムから分離できるか否かを調べる。実験２細胞壁溶解直後の菌体を電子顕微鏡で観察する。実験３安定型Ｌ－ｆｏｒｍ(EcL株）のｓｐｉｒｏｓｏｍｅを調べる。 Spirosomeの局在を調べる目的で細胞膜を壊さずペリプラズムの蛋白を分離することを試みたリゾチーム液で処理した菌体を３％ NaCl 液に懸濁し、攪拌処理によりペリプラズム蛋白を外液に遊離させる細胞壁ペリプラズム細胞膜細胞質内 Absorbance(A600 ) NaCl ２％以上の溶液中で攪拌してもスフェロプラストはほとんど壊れない 1 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 更に１００００回転３０分遠心 Concentration of NaCl(%) リゾチームで作成したスフェロプラスト ①攪拌前スフェロプラスト NaCl溶液中で 30秒間攪拌３０００回転１５分遠心 ③攪拌後上清 ②攪拌後スフェロプラスト結果スフェロプラストを 3 ％ NaCl 溶液中で撹拌した場合の spirosome 蛋白１２３１撹拌前のスフェロプラスト菌体２撹拌後のスフェロプラスト菌体 94 ３攪拌後の上清 67 - 矢印 spirosome 蛋白 kDa 43 - 30 - 攪拌によってｓｐｉｒｏｓｏｍｅがペリプラズムから遊離したと考えられる大腸菌スフェロプラストを1.75％ NaCl液に懸濁し、攪拌した前後の蛋白の比較１ kDa ２３１．撹拌前のスフェロプラスト菌体２．撹拌後のスフェロプラスト菌体 94- ３．上清成分。 6743- Spirosome 60kDa 30- E.coli B 30℃と45℃培養（PYG培地静置培養）による60kDa 蛋白の発現 1 2 1 30℃ 培養 94 2 45℃ 培養 67 矢印 60kDa蛋白 43 結果 30 60kDa蛋白は、30℃培養に比較して45℃培養で著しく増加した大腸菌スフェロプラストを1.75％ NaCl液に懸濁し、攪拌した前後の蛋白の比較と、 60ｋDa蛋白の抗 HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング A １ kDa 946743- ２３ B ３ kDa 94 67 43 30A, １．撹拌前のスフェロプラスト菌体２．撹拌後のスフェロプラスト菌体３．上清成分。 B, 攪拌後の上清成分（A,３）のウエスタンブロッティング。矢印 60kDa蛋白安定型Ｌ－ｆｏｒｍ株の６０ kDa 蛋白を調べた (35℃､8時間培養）１ kDa 94- 67- 43- 30- ２ E.coli の安定型 L-form （ＥｃＬ株）１ E.coli B （全菌体）２体） E.coli L-form （全菌矢印 spirosome蛋白矢印 60 kDa 蛋白 35℃ 培養のL-form EcL株には spirosome 蛋白と同様に60 kDaに相当するバンドがなかった大腸菌の安定型L-form株と野生株におけるHSP60の比較 (45℃､8時間培養） A 1 2 3 B 1 2 3 A, SDS-PAGE １．野生株全菌体 kDa 94 94 ２．安定型L-form株全菌体 67 67 ３．培養上清 43 43 B, 抗HSP60モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティング。１．野生株 30 30 ２．安定型L-form株３．培養上清矢印 60kDa蛋白 45℃培養の安定型L-form株にも６０ kDa 蛋白のバンドは見られなかった E.coli の野生株と安定型L-form株における HSP60の発現 1 2 3 4 5 kDa 2 E.coli B株 45℃ 培養全菌体 67- ポンソーS染色 67- 1 E.coli B株 37℃ 培養全菌体 3 E.coli L-form株 37℃培養全菌体 4 E.coli L-form株 45℃培養全菌体 5 E.coli L-form株ウエスタンブロッティング 45℃培養の培地 L-form株は45℃で増殖できる。しかしHSP60は発現していない。大腸菌スフェロプラストを1.75％ NaCl液に懸濁攪拌し、1万回転30分遠心で菌体を除いた上清を4万回転､2時間の遠心分離で得た沈査の電子顕微鏡像矢印はHSP60像、スケールは100ｎｍ本法で精製（分別遠心）したHSP60の電子顕微鏡像（ネガティブ染色） Viitnen P.V,et.al. 1992 J.B.C. まとめ１．大腸菌のスフェロプラストを１．７５％NaCl 液中で攪拌すると60KDa蛋白は細胞分画より外液の方により多く見られた。また安定型L－form株ではこの蛋白が検出されなかった。２．この60KDa蛋白は抗HSP６０モノクローナル抗体によってHSP６０であることが確認された。３．大腸菌のHSP６０がペリプラズム（または菌体表面）にある可能性が示唆された。 NATURE Vol 392 1998 リゾチーム処理直後の菌体（E.coli ）にみられた spirosome （第80回報告） Clostridium hiranonisの規則的配列構造と比較した部分規則的配列構造が見られた菌体３分後に表面から離脱する長いspirosomeが見られた 100 nm