C - 41 酵素とインテリジェント材料を用いた殺菌システムの研究 ∼ 溶菌酵素の精製とクローニング ∼ ○ 井川聡客員研究員酵素応用グループ藤原信明、増井昭彦大阪府立公衆衛生研究所鈴木定彦材料技術部背景と目的ゼラチンゲル現在、切削加工において、切削油の腐敗防止のために大量の化学殺菌剤が使用されているが、人体や環境への悪影響が懸念されている。そこで溶菌酵素とゼラチンゲルなどのインテリジェント材料を用いた新規殺菌システムの開発が進められている。これまでに腐敗初期の主な原因菌である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を効果的に溶菌する酵素を生産する菌株Bacillus clausii N7を得ているが、その酵素生産量は非常に少なく工業的に用いるための障害となっている。本研究では組み換えタンパク質発現系を用いた溶菌酵素の大量生産を行うために、まず本酵素を精製し、さらに酵素遺伝子のクローニングを行った。プロテアーゼ溶菌酵素緑膿菌の増殖緑膿菌溶菌酵素による殺菌新規殺菌システムの模式図緑膿菌が分泌するプロテアーゼの働きにより溶菌酵素が必要なときにだけ放出され、緑膿菌の増殖を抑える。酵素タンパク質の精製 (kDa) 1 2 3 4 175 B. clausii N7の培養上清を濃縮し、硫酸アンモニウム塩析による分画を行い、溶菌活性の高いフラクションを回収した。その後、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーを経て、最終的に約110kDaの溶菌酵素を電気泳動的に単一になるまで精製した。この酵素のアミノ酸配列の一部を決定したところ、枯草菌（Bacillus subtilis）の溶菌酵素の一種であるN-acetylglucosaminidaseと高い相同性を示すことが明らかとなった。溶菌酵素 83 Lane 1 : 分子量マーカー 2 : 50% 硫酸アンモニウム沈殿 3 : 陰イオン交換カラム溶出物 4 : 疎水カラム溶出物（精製酵素） 47.5 32.5 精製酵素の電気泳動による解析塩析、イオン交換、疎水クロマトグラフィーを経て、最終的に約110kDaの単一なタンパク質を得た。 (kb) 酵素遺伝子のクローニング 23 9.4 6.5 4.4 2.2 精製した酵素のアミノ酸配列をもとにプライマーを作製し、PCRによる部分遺伝子の増幅を行った。さらに増幅された遺伝子の配列を基に新たなプライマーを作製し、最終的に溶菌酵素遺伝子全長を含むDNA断片をクローニングした。塩基配列を解析した結果、溶菌酵素の構造はN末端に触媒ドメインを持ちC末端側にSH3bドメインの繰り返しを持つ、特殊な構造をしていることが予想される。シグナルペプチド H2N LYZ 溶菌酵素遺伝子を含むDNA断片クローニングベクター電気泳動による溶菌酵素遺伝子の確認 PCRで増幅したDNAをベクターにクローニングした。このDNA断片には溶菌酵素遺伝子の全長が含まれていた。 SH3bドメイン SH3b 触媒ドメイン SH3b SH3b SH3b SH3b SH3b SH3b 予想される溶菌酵素の機能構造 SH3b SH3b SH3b COOH