神奈川児立教育センター研究集録１３：２９−３２ ．１９９４ 組織培養の教材化に関する研究 一プラスチックフィルムを用いた培養容器の改良一 渡辺克己 ’ 組織培養の教材化に際し 、培養容器の蓋は改良すべき点の一つである 。ラッ プフィルムやポリプ ロ袋など のプラスチ ックフィルムを蓋として用いることにより 、現在広 ’く用いられているガラス曲管付きゴム栓と同 様の効果が得られ 、作業能率は向上した 。また 、フィルムケースや コーヒーびん等の利用が可能となった 。 変化の大きい培養条作下で 、両方の条件を満たすの は じ め に はかなり難しい問題である 。 現在使用されている 、ガラス曲管付きゴム栓 組織培養は初歩的なパイ・ オテクノロジーとして ・ア ルミホイル ・ミリシール等が通気型の蓋であるのに 、 高等学校の部活動を中心にかなり普及してきた 。し 対し 、今回開発したプ７スチ ックフィ 、！レムを用いた かし 、授業中の実験として取り入れる場含には 、教 蓋は 、フィルム成分を通して拡散しでくる気体を利 科としての指導目的の明確化 、限られた時間内に未 用する 、いわぱ密閉型の蓋である 経験な生徒が実験するための指導方法と技術の確立 。 、 多数の生徒が同時に実験できる設備と生徒に適した １材料 用具類の改良 、短時間で期待される結果が確認でき 本研究で使用したプラスチ ックフィルムは第１表 る材料の開発等 、解決すぺきいくつかの課題がある の通 ように思われる ‘）である 。 。 学校で行われて’ いる組織培養の実験で失敗する主 第１表 プラスチ ックフィルムの種類 な原因は 、無蘭操作を行う条件とその後の培養条作 に大別される 。前者は設備の改善と生徒の訓練で比 物 質 名 等 商晶名等 較的容易に解決されるが 、後者あ解淡は培養装置な ．ど犬きな設備を必要とするため容易ではなく 、又 ポリ塩化ビニリデン 食晶用ラッ プ 見逃され易い部分ぞある 。結果とし亡溢度変化が大 ポリ塩化ビニール 食品用ラ ップ きい理科室等では 、培養中に容器内に雑南が侵入し ポリェチレン 食晶用ラッ プ 失敗する場合が多い ニ軸延伸ポリプ ロピレン（２０仰） ＯＰＰ袋 今回は 、生徒実験を念頭に置き 、日用品として市 無延伸ポリプ ロピレン ポリプ ロ袋 販されているプラスチ ックフィルムを用いて 、温度 ポリエチレン （２０〃ｍ） ポリ袋 変化の犬きい条件でも雑薗の侵入の少ない培養容器 フロロカーボン ミりシール 、 。 の蓋の開発と実験方法の改良を行 った ’（４０〃ｍ） 。 本実験において主に使用したポリ塩化ビニリデン はサランラ ップ 、０Ｐ盲袋はミヤロン防曇袋 、ポリ Ｉ 培養容霧の蓋の開発 プロ 袋はＨｅｉｋｏｕ ポリプ ロ袋である 。 培養容器の蓋は 、￠雑菌の侵入を防ぎ 、ゆ適度の 通気性（酸素 ’二酸化炭素は高く 、’ 水蒸気は低 い方 がよい）があり 、＠操作性の良いものが好ましい ２ 蓋の透湿性 （１）方 法 。 しかし 、￠と は相反する性格を持 っておリ 、温度 ￠ 直径３０ｍ 、長さ９０ｍの管ぴんに 、約１０ｍ尼の０ １ 教科第二研修室（生物）’ て蓋する二 ． ８％寒天を入れ 、容器の口をそれぞれの材料を用い 研修指導主事 一２９一 ＠酸素濃度計のセンサー部分に取り付け可能な 同様の管ぴんを３本ずつ用意し 、温度２７ ．ト ３０ ．Ｏ℃ 、湿度３６−９１％の条件下に置く フィルム等を装着するための装置を作製する 。 。 直径３０ｍの試験管を口の部分から９ｃｍの所で切断 ２−１０日おきに重さを量リ 、減少量の平均に より各材料の透湿性を求める 、 し、 切断部分に内経１５ｍあビニールチューブを取り 。 付けた９号のゴム栓を接着する （２）結果と考察 ３０日後の測定結果を第１図に示す 容積は約５０ｍ且となり 。 。 、試験管の口が培養容器の口に 相当する 。第２図参照 。 ＠ ＠の装置をそれぞれの材料により蓋する 。フ 釦 ２ ィルムをかぷせた上から輸ゴムを幾重にもかけ密閉 曇 度を高めるように留意する 。 ＠ ＠の内部を窒素ガスで満たし 、素早くセンサ ー部分に取り付ける 。この操作が正確に行われれぱ の １ 装置内の酸素濃度は１ ．０％以下になる 警 。 窒素ガス充填後１０分間を経過し 、装置内の酸 素濃度が１ ．Ｏ％以下の値を示していることを確認し てから測定を開始する 。温度２６ ．０−２９ ．５℃の条作下 （９） 装置内の酸素濃度を１時間毎に測定し 、開始時 で、 ｏ ■６９ ’ガラス曲閉寸きゴム栓 からの増加量により酸素透過性を表した 。 魔塞蜜７ルミホイル ■ミリ…戸ル 囲囲二軸延伸ポリプロ膜 脇ポリエチレン膜 魎園痴化ビニリデンラップ 囮ポリエチレンラッ プ ［コ坦化ビニールラップ 第１図 各蓋の透湿性 ￠ ガラス曲管付きゴム． 栓（Ｏ ．１５９／３０ 準とした場合 、アルミホイル（Ｏ ピニリデン（Ｏ ．０８９） ．０４９） 即を標 ・ポリ塩化 ・二軸延伸ポリプ ロピレン（Ｏ ． １１９）・ ポリエチレン（袋）（０ ，２０９）などは 、培 地の水分を保持する意味では 、培養容器の蓋として 適していると思われる 第２図 酸素濃度計と透過量測定装置 。 組織培養の専用部晶であるミリシール ・（Ｏ ．４７ （２）結果と考察 ９は 、培地の乾燥が起こり 、小型の培養容器を用い ることの多い 学校での実験には不適当であると思わ ８時間後の装置内の酸素濃度は 、第３図の通りで れる ある ． 。 回 ＠ アルミホイルの結果が非常に低く出ているが この場合 、装着する際の技術によ １）大きな差が生じ Ｑ二軸延伸ポリプ ロピレンの場合 、８時間後に 、 ４． 、 ８％の酸素濃度の上昇が見られ 、１時間の平均で 。この値は１時間毎に測定した値と この結果を得るためにはかなりの訓練を必要とする はＯ ．６％となる と思われる よく一致している 。 。 ＠ 外気との酸素濃度の差により透過速度には差 ３ 蓋の酸素透過性 が見られるが 、全体としてはほぽ時間に比例してい （１）方法 ０酸素濃度の測定は 、ガステ ック社製酸素濃度 ると考えられる ＠ ガラス曲管付きゴム栓を標準とした時 、プラ 計モデルＧ０ −５０型を使用した 。第２図参照 スチ ックフィルム類の酸素透過性は 、ほぽ１／３の 。 一３０一 。 値を示している 。二軸延伸ポリプ ロピレンの場合 高温度が３３−Ｏ℃の条件下にほぽ２週間置きその後２７ 、 ． 酸素透過量はＯ ．３ｍ２ ／時間とな ｉ） ・管びん等底面積 の小さい容器を用いた培養では特に不足する量では ないと思われる Ｏ℃で１週間培養して雑蘭の侵入状況を調べる 。 （２）結果と考察 Ｑ ３週間後 、管ぴん ・アルミホイルの１／３ 。 、 管ぴん ・ミリシールの１／３に雑蘭の侵入が見られ ８釦 たが 、他の容器には見られなか った 蔓 プラスチ ックフィルムは 、多様な容器に対し の て、 １釦 。 温度変化の大きい 条件で雑菌の侵入を防ぐ蓋と して利用できると思われる 。 ＩＩ夷験方法の改良 （％）佃 組織培養を教材として一般化するためには 、未経 験な生徒が実験しても成功するような方法を開発し なけれぱならない 。従来の滅薗方法では培養容器に ■９ガラス曲讐付きコム栓 麗萎１１７ルミホイル ■ミリシール 蓋をした状態で滅薗し 、植物を植え付けるために蓋 厘田ボリエチレン膜 脇ポリ塩化ビニリデン膜 を外し 、その後同じ蓋をすることが多く 、馴れない 目睡１ポリプロピレン膜 生徒にとってはかなり難しい 作業となる 。本研究で 囮二軸延伸ポリプロ膜 は、 第３図 各蓋の酸素透過性 る分離滅菌の方法と 、＠培養容器にプラスチ ックフ ￠培地の入 った容器と蓋を分離し別々に滅菌す ィルムを簡単 ・確実に装着する方法について検討し ＠ フィルム面を通して拡散する気体の量はフィ た。 ルムの面積と比例するので 、口の大きい容器を用い ることにより酸素の透過量を増やすことができると 思われる １ 培地の滅菌方法 （１）方 法 。 培地の入 った培養容器にポリプ ロ袋をかぷせ 、輸 ４ 雑菌の侵入状況 ゴムで止めて１２１℃で１５分間滅菌する （１）方法 。 （２）結果と考察 Ｑ 直径３０ｍ 、長さ９０ｍの管びんに 、約１０ｍ尼の組 ０ この方法によ ＾）培地の滅南が可能であり 、滅 織培養用培地（シ 蘭後１ヶ月以上室内に放置しても雑蘭が侵入するこ ョ糖３０９ ・ハイポネ ックス３ ．０９ ・寒天８ ．０９／１）を入れ滅薗し 、容器の口を とは殆ど無か った 、ガラ ス曲管付きゴム栓 ・アルミホイル ・ミリシール 。 ＠ ポリプ ロ袋には大小何種類もの大きさがあリ． ・二 軸延伸ポリプ ロピレン膜 ・ポリ塩化ピニリデン膜に 適当なものを選ぷことにより色 々なぴんの滅菌が可 より蓋する 。同じものを３本ずつ準備する 能となった 。 ＠ フィルムケース（富士写真フィルム社製） 。 ＠ 加圧滅蘭の際培養容器の蓋がはずれる心配が ・ 遠沈管（ストックウエル社製）・ コーヒーぴん（ネ なく スカフェ ゴールドブレンド１００９用）に０と同様の 滅菌できる容器の数が増える点でも適当な方法であ 培地を入れ 、滅蘭し 、二軸延伸ポリプ ロピレン膜 ると思われる ポリ塩化ピニリデン 膜により蓋する 本ずつ準備する 。・ ・ 、また 、ガラス曲管付きゴム栓に比べて一度に 。一 同じものを３ ２ フィルム滅菌用具の製作 。 ＠ 培養用フラスコ ・広口の清涼飲料のぴん （１）方 法 ・麺 つゆのぴんを＠と同様に処理する 。同じものを３本 ￠ プラスチ ックフィルムを用いる場合は 、培養 ずつ準備する 容器の口の直径の３借の大きさが必要である 。容器 。 ＠ Ｏ ＠を夜間の最低温度が１４ ．０℃ 、日中の最 の大きさに合わせて画用紙を切リ 、二つ折にして適 一３１一 当な位置に容器の口よリも大きい穴をあける（円切 りカ ッターを用いると便利である）。 第４図参照 。 第５図 コーヒーぴんへのフィルム装着 （２）結果と考察 第４図 フィルム滅薗用具 ￠培地を滅蘭する時の蓋と培養時の蓋を分ける ＠プラスチ ックフィルムを適当な大きさに切１） ０の画用紙にはさむ ことにより 、植物を植え付ける際にはそのことだけ に注意を集中でき 、作業能率が向上した 。結果とし 。 ＠＠を１枚ずつ封筒にいれ 、まとめて大きなポ リプ ロ袋に入れ 、加圧滅蘭する て失敗が少なくなると思われる 。 ＠ コニヒーぴんの蓋 ・フィルムケース ・遠沈管 。 などを用いることにより 、経験に関係なく 、同じよ （２）結果と考察 ０ オートクレープによる加圧滅蘭で容易に滅薗 うに培養容器の蓋を装着することができる 。 することが出来た 。ただし 、乾熱滅菌を行う場合は 温度 、時間とも異なると思われる 摘． 。 要 ポリ塩化ビニリデンのロールに巻いてある内 側を用いた場合は特に滅蘭操作を行わなくとも雑南 の繁殖は見られなか った フィルム滅蘭用具を工夫することにより 、プラ １． スチ ックフィルムを培養容器の蓋として使用する 。 ことができる 透湿性 ・酸素透過性の点から 、二軸延伸ポリプ ２． ３ 作業手順 ロピレン ・無延伸ポリプ ロピレン ・ポリ塩化ビニ リデン ・ポリエチレン（袋）は 、培養容器の蓋と （１）方・ 法 コーヒーぴんを用いた場合の例を示す 。 。 ０ ポリプ ロ袋がかぷ った滅蘭済：みの培地とフィ して使用することができる ルム入りの封筒を無蘭箱内に入れる 。コーヒーぴん ３． プラスチ ックフィルムを用いることによリ 、利 用できる容器の範囲が広がり 、温度変化の大きい の蓋には 、パッ キンごと直径４ｃｍの穴をあけ（ホ ールソーを用いると便利である）、 ビニール袋に入 培養条件でも 、雑薗の侵入が少ない培養容器の蓋 を作ることができる れて 、７０％エタノールを噴霧しておく。 ＠ ポリプ ロ袋を外し 、植物を植え込む等の作業 を行う 。 ４． 。 培地と蓋を分離して滅蘭する方法と 、培養容器 にフィルムを簡単 ・確実に装着する方法の開発に 。 より 、組織培養の作業能率を高めることができる ＠ フィルム滅蘭用具を封筒から取リ出し 、コー ヒーぴんんの上に載せる 。コーヒーぴんの蓋をフィ ルムの上から押しつける 。第５図参照 参考文献 。 ＠ フィルム滅薗用具を外し 、コーヒーぴんへの プラスチ ックフィルム蓋の装着が完了する ＠ 同様な方法によリフィルムケース 、遠沈管等 １． 。 でもフィルムを装着することができる 。 一３２一 上野景平１ ６９１身のまわりの化学物質講談社 。
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