遺伝子の解析第１弾 DNAについて＆PCR法遺伝子とは？ＤＮＡ（ＤｏｅｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ） • ２本の鎖がお互いに絡まりあったような構造 • 規則正しく螺旋状になっている構造 • 前に進むにつれて右巻き（時計回り）に回る構造二重螺旋構造 double helix １回転（ピッチ）で３４Å＝１０base ヌクレオシド〔nucleoside〕とヌクレオチド〔nucleotido〕二重螺旋構造の各々の鎖はヌクレオチドという単位の繰り返し（重合）でできています。アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）というプリン塩基、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）というピリミジン塩基にデオキシリボースという五単糖が結合したものをヌクレオシドといい、さらにリン酸が結合したものをヌクレオチドという。 A ５´ ４´ ３´ ２´ 糖Sugar １´ ＋Ｐ＋ T G C ヌクレオシド＝Ｐリン酸 Phosphate 塩基Base ヌクレオチドＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＤＮＡの模式図ＰＰＰＰＰＰ３´末端Ｐ５´末端水素結合 A Ｇ A A Ｃ T Ｃ T Ｃ T T Ｇ A Ｇ５´末端３´末端ＰＰＰＰＰＰＰＤＮＡについてのまとめどこにあるのか？何をしているのか？細胞核（ミトコンドリアにも全ＤＮＡ量の約0.1～0.2％を含む）どのような構造か？２本のポリヌクレオチド鎖が、A-T、G-Cの水素結合による塩基対を形成し、１０対を一巻きとする、右巻きの２重らせん構造。その他遺伝情報の伝達１、ＤＮＡのA/T比、G/C比はほぼ１。２、（A+T）/（G+C）の比は生物種により固有。 0.35～2.70の値をとる。ヒトでは1.52、酵母では1.79、大腸菌では0.95。３、ＤＮＡの分子量は数百万以上。ヒトでは細胞１個あたり約５～６pgのＤＮＡを含む。ＤＮＡの変化 • ＤＮＡは加熱（通常７０℃以上）によりdouble helixがほどけてランダムコイルになる。これを変性（denaturation）または融解（melting）という。 • 変性が進むにつれて紫外吸収（２６０ｎｍの吸光度）が増大し、完全に変性すると４０～５０％の吸光度変化が見られる。これを濃色効果（hyperchromic effect）という。 • ５０％の変性が起こる温度を融点（Ｔｍ：midpoint temperature）という。水素結合が３対あるG-C結合は、２対のA-T結合より安定なのでG-C結合が多いほどＴｍは高い。 • 変性したDNA溶液を冷却すると、相補的な鎖はひとりでに結合して元の2本鎖に戻る。これをアニーリング（焼きなまし）という。ＰＣＲ（Polymerase chane reaction）法ＰＣＲ法とは？ステップ１（Denaturation：熱変性）、ステップ２（ annealing：焼きなまし）、ステップ３（Extension：伸長反応）の３ステップを１つのサイクルとして１つのテンプレート（鋳型）DNAから２つの複製を作り出し、この反応を何サイクルも行うことでDNAを指数関数的に大量に増幅させる方法指数増幅期サイクル数プライマー５´ スタート時０１個＝２個１サイクル終了時２サイクル終了時１２２個＝２個４個＝２個 Ex) ２５２５サイクル行うと２個・・・・・・・・・・・・ PCR産物の増幅 nサイクル終了時 n ２個３３,５５４,４３２個 PCRの各ステップについてステップ１（熱変性：denaturation）まず93～95℃に加熱することにより二本鎖になっている、テンプレート（鋳型）となるＤＮＡを引き離しプライマー（ＤＮＡを酵素的に合成する際に使われる２０～３０塩基対の短いＤＮＡ断片。増やしたい部分の両端に結合する塩基配列を持つ。）がテンプレートに結合できるような状況をつくる。テンプレートＤＮＡ５´ ３´ ３´ ５´ テンプレートＤＮＡ５´ ３´ ３´ ５´ 加熱（９３～９５℃）５´ ３´ ３´ ５´ ５´ ３´ ３´ ５´ ステップ２（アニーリング： annealing）それぞれの一本鎖の相補的な部分にプライマーが二本鎖を形成できる（annealing）温度まで冷却し、伸長反応が起こるようにする。３´ ５´ ５´ ３´ ３´ ３´ ５´ プライマー５´ 冷却（５０～６０℃）５´ ３´ ３´ ５´ ５´ ３´ プライマー３´ ５´ 冷却（５０～６０℃）３´ ５´ ３´ G G T G C C C A C C C G G G T C A T A ステップ３（伸長反応： Extension ）プライマーを起点として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素により５´ から３´方向にＤＮＡ合成が起こり、ＤＮＡの２本鎖が作られる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ完成ＤＮＡ鎖の伸長反応（５´→３´へ向かう）プライマーＰ OH ＰＰ５´末端３´末端Ｇ A A Ｃ T DNAポリメラーゼにより次のTに相補的な P が選ばれ、３´末端の-OH基が５´末端のリン酸基とホスホジエステル結Ｇ合する T T A ３´末端新しくできた部分ＰＰテンプレートDNA ＰＰＰ OH ＰＰＰ５´末端 A Ｇ A A T Ｃ T T Ｇ３´末端ＰＰＰＰ PCR法の臨床応用 • • • • 結核菌、その他の細菌検査 HCV核酸定性、定量検査ミトコンドリア病の診断非侵襲的出生前診断（母体血中を循環している胎児細胞を用いる） • 染色体異数診断などなど・・・・・・参考文献など改訂遺伝子工学実験ノート（羊土社）改訂第２版生化学ガイドブック（南江堂）遺伝子の部屋 http://web.wtez.net/n/s/ns54007/gene/gene_main.html DNAシークエンス（ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む）原理オートシークエンサー（ABI PRISM３１０）のための反応では合成されるDNAを蛍光物質で標識します。このDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析します。 ABI PRISM３１０について ABI PRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞれに、励起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（Dye Terminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径５０μｍのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそれぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができる。