SSR マーカーを用いたアミタケの遺伝構造の解析 1. はじめに外生菌根菌は、樹木の根と外生菌根を形成して樹木の無機養分吸収を促進する一方、光合成産物を受け取って自らの炭素源とするという共生関係を結ぶ一群の菌類であり、森林における物質循環でも大きな存在であることが明らかにされつつある。また、森林に発生する外生菌根菌の子実体には、マツタケをはじめ、ホンシメジやイグチ類など優良な食用キノコとして国の内外を問わず市場に広く流通するものも多く、その遺伝構造の解析や発生位置の経年変化などから推察される繁殖様式を明らかにすることは、森林生態系の理解のみならず、森林を利用した食用キノコの増産にも資するものと考えられる。これまで、地掻きや除伐といった林内施業が外生菌根菌の子実体発生量に及ぼす影響については、正負両方の効果が報告されていることから、アカマツ天然林内に設置した試験地に優占して発生したアミタケを対象に、林内施業後の子実体の発生状況とジェネット分布の経年変化を調査し、施業がアミタケの発生動態に及ぼす影響について検討をおこなってきた。その際の遺伝構造の解析方法には、PCR 法を利用した ISSR 多型解析法、および、菌類の自己/非自己の認識機構である体細胞不和合性（somatic incompatibility）と呼ばれる性質を利用し、菌類の種内の遺伝的関係を解析する手法として古くから用いられる対峙培養、の２種類を用いてきた。現在最も識別能力が高いとされる SSR マーカーについては、ここ数年になって簡便な開発方法が報告されており、 Lian et al.（2001）の方法によってアミタケについても数種類の SSR マーカーを開発することができた。本研究では、新たに開発した SSR マーカーを用い、試験地に発生したアミタケについてジェネットの再解析を行い、上記 2 手法による解析結果との比較を併せて行うことを目的とした。 2. 材料と方法・試験地：広島県加計町のアカマツ天然林に 10m×10m の試験地を 4 区画設置し、2 区画で除伐および地掻きの施業を 1996 年 8 月に行った。その後、1998～2001 年の 4 年間、アミタケ子実体の発生開始から終了まで 1～2 日おきに子実体を採取し、発生位置を記録した。採取した子実体は持ち帰って分離を行い、ジェネットの解析に用いた。・SSR マーカーによるジェネットの解析：分離菌株の培養菌糸から抽出した DNA を鋳型として、数遺伝子座について解析を行った。 3. 結果と考察・ジェネット分布と遺伝子頻度の経年変化最も多くの多型の見られたマーカー Sb-CA1 および、 Sb-CA4 について、その対立遺伝子頻度の分布の経年変化を図-1、2 に、ヘテロ接合度の観察値（Ho）と期待値（He）を表１に示した。解析結果は両者で完全に一致していた。表 1.Sb-CA1, CA4 の対立遺伝子数とヘテロ接合度の経年変化いずれの年、いずれの処理区においても、ヘテロ接合度は観察値の方が期待値よりも高く（表 1）、胞子散布による繁殖を盛んに行っていたことを示唆するものと考えられた。その一方で、いずれの処理区においても、毎年発生位置を大きく変えながらも、同一の遺伝子型の子実体が４年にわたって優占して発生していたことから、菌糸の成長によって土中に広く分布した菌糸マット中から毎年ランダムに子実体発生を行っている可能性も考えられ、今後、地下部におけるアミタケの菌根とそのジェネット分布についての調査を行っていく必要があるものと考えられた。・対峙培養および ISSR 多型解析との結果の比較調査期間を通じて大きく優占していた各ジェネットについては、ほぼ完全に一致する結果が得られた。しかし、対峙培養や ISSR 多型解析で同一のジェネットと判定された菌株でも、本研究での解析結果では異なるジェネットに属すると判定されるものも少数ながら存在した。それらは、 Sb-CA1, CA4 の各遺伝子座でホモ接合となっている場合が多く、ISSR 多型が優性マーカーであることに由来する識別能力の限界である可能性が考えられた。引用文献 Lian C, Zhou Z, Hogetsu T (2001) A simple method for developing microsatellite markers using amplifying fragments of inter-simple sequence repeat (ISSR) J. Plant Res. 114: 381-385 0.60 0.50 Sb-CA1 117-127 6 Sb-CA4 159-169 6 1999年 2001年 5 6 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 1 2 3 4 図-1 Sb-CA1、CA4 の対立遺伝子頻度の経年変化両者で完全に一致する結果が得られたため、一つの図で示す。縦軸は遺伝子頻度、横軸は対立遺伝子を表す。図中の対立遺伝子 1-6 のサイズはそれぞれ、CA-1 では 127,125,123,121,119,117bp、 CA-4 では 169,167, 165,163,161,159bp であった。施業区１対照区１ 0.80 0.80 1998年 2000年 0.70 0.60 1999年 2001年 0.70 0.60 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.20 0.20 0.10 1998年 2000年 1999年 2001年 5 6 1998年 2000年 1999年 2001年 5 6 0.10 0.00 0.00 1 2 3 4 5 6 1 2 施業区２ 3 4 対照区２ 0.80 0.80 1998年 2000年 0.70 0.60 1999年 2001年 0.70 0.60 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.20 0.20 0.10 0.10 0.00 0.00 1 遺伝子座サイズ (bp) 対立遺伝子数 1998年 2000年 2 3 4 5 6 1 2 3 4 Ho He 図-2 各区における対立遺伝子頻度の経年変化 0.959 1.000 0.994 0.885 0.753 0.707 0.797 0.806 (1998年）いずれの処理区においても、複数の遺伝子型の同一ジェネット (1999年）が調査期間を通じて優占しており、遺伝子頻度の変動は新たなジ (2000年）ェネットの発生ではなく、各ジェネットに属する子実体の発生本 (2001年）数の変動が主な要因であった。