DNAの複製（replication ）・Proof readingについて・PrimerのTm値について DNAの複製この範囲を複製すると・・・５´ ３´ ３´ ５´ 複製フォーク５´ ３´ ３´ ５´ 複製開始点複製フォークの拡大３´ RNAプライマー複製フォークの進行方向５´ リーディング鎖合成は連続的５´ ３´ 岡崎フラグメント５´ ラギング鎖３´ ５´ 合成は不連続 RNAプライマー３´ ５´ DNA合成が進んで先にあるRNAプライマーのところまでくると、RNAを分解しながら、合成は進み、さらに DNAのところまで到達するとリガーゼでつながる。５´ ３´ ３´ ５´ リーディング鎖ラギング鎖がつながる複製の正確さ DNAポリメラーゼには５´から３´へのポリメラーゼ活性（鋳型DNA に合う正しいヌクレオチドを選択し、取り込み、つなげて行く）のほかに、３´から５´へ向かうエキソヌクレアーゼ活性（付いたばかりのヌクレオチドが誤っていれば切り出して修正する）があります。この誤りを修正する機能を校正活性（Proof reading）といいます。 A ５´ ３´ ５´ ５´ T A ３´ ５´ T ポリメラーゼ活性 G G ５´ ５´ ３´ T ５´ ３´ エキソヌクレアーゼ活性 T ５´ 正しいヌクレオチドが選択された時ポリメラーゼ活性＞＜エキソヌクレアーゼ活性誤ったヌクレオチドが選択された時不適正塩基修正酵素（mismatch correction enzyme）新しくできたDNAのなかから、誤った塩基対を探し出し、誤った塩基を除去して正しい塩基に入れ替える酵素。どちらが誤っているのか何故わかるのか？ A G どちらが誤り？ 1.鋳型鎖の近傍のメチル化されている塩基を見つけ、合成されたばかりで、まだメチル化されていない方の鎖の方を新生鎖と認識して新生鎖のヌクレオチドを除去して修正する。 2.新生鎖（ラギング鎖）には必ずニック（切れ目）があるので、それがあるほうを新生鎖として認識して修復する。ミスマッチニック DNA誤対合修復タンパクが結合新生鎖の方を除去再び複製 Tm値を求める方法 I．最近接塩基対法(Nearest Neighbor method) Tm = 1000ΔH -273.15+16.6log[Na+] -10.8+ΔS+Rｘln（Ct/4） ΔH：ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（kcal/mol） ΔS：ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（cal/mol・k） R：気体定数（1.987cal/deg・mol） Ct：プライマーのtotalモル濃度[mol/l] Na＋：Buffer中のNa+のモル濃度[mol/l] 最近接塩基対パラメータ Interaction ΔH[kcal/mol] ΔS[cal/mol・K] AA/TT -9.1 -24.0 AT/TA -8.6 -23.9 TA/AT -6.0 -16.9 CA/GT -5.8 -12.9 GT/CA -6.5 -17.3 CT/GA -7.8 -20.8 GA/CT -5.6 -13.5 CG/GC -11.9 -27.8 GC/CG -11.1 -26.7 GG/CC -11.0 -26.6 ※表の見方 Interactionは次のように表記しています 5'→3' 3'←5' ＡＴ／ＴＡ例えば、AC(5'→3')のΔHは、GT/CAのΔH：－6.5[kcal/mol]となります Ex) ５´末端計算方向３´末端 A G C T A T G C AG GC CT TA AT TG GC -7.8 -11.1 -7.8 -6.0 -8.6 -5.8 -11.1 ΔH＝-7.8-11.1-7.8-6.0-8.6-5.8-11.1＝-58.2kcal/mol 同様にしてΔS＝-148.7cal/mol・k 1000x(-58.2) Tm=-10.8-148.7+1.987 In{(0.5x10 -6)/4} = 9.83 -273.15+16.6log(0.05) 例として、Ct：プライマーのモル濃度を0.5μM、Naイオンのモル濃度を50ｍMとして計算 II ．Wallace法 Tm= 2ｘ（A+T）+4ｘ（G+C） A、T、G、C：各ヌクレオチドがプライマー中に含まれる数 III．GC%法 Tm = 81.5+16.6log[Na+] + 41( XG + XC ) - 500/L XG,XC：プライマー中のGおよびCのモル分率 L：二本鎖を形成する部分のオリゴヌクレオチドの長さ（mer） Ex)以下の塩基配列のプライマーを用いて各計算式で計算してみますと・・・ 24mer ５´ ３´ CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 便宜上すべて[Na+]=50×10-3、プライマー濃度Ct＝0.5×10-6で計算します。 I．最近接塩基対法(Nearest Neighbor method) ΔH=－192.7[kcal/mol] Tm= ΔS=－481.4[cal/mol･K] 1000x（-192.7） -273.15+16.6log(50x10 ) -10.8-481.4+1.987 ln{(0.5x10 -6)/4} = 73.2℃ II ．Wallace法 Tm= 2ｘ（7+4）+4ｘ（7+6） = 74℃ -3 III．GC%法 Tm= 81.5+16.6log(50x10-3) + 41(7/24+6/24) - 500/24 = 61.3℃ それぞれの計算方法の違いにより、Na+濃度等を統一してもTm値は異なります。特に 10mer以下の短鎖、50 ～60mer以上の長鎖、GC%が大きく偏る配列においてはこの差が顕著になります。参考文献等分子生物学講義中継part 1（羊土社） GENOMES second edition（MEDSI） http://www.genosys.jp/whatsnew/tm/tm_syosail.html#tm_tmkeisan