リゾチームによる細菌分解反応〜はたして体内できちんと働いているか〜茨城県立水戸第二高等学校矢口歩美（２），石塚なつみ（２），塙千広（２），浜田健志 1. はじめに酵素について学習しているとき、その複雑な働きに興味をもった。私たちが扱うのはリゾチームで、細菌を殺す働きがある。文献によると、最適温度は 50℃だが、ヒトに含まれるリゾチームは体温である約 37℃で働いている。私たちは、リゾチームが体内でどの程度働いているのか疑問をもち、酵素活性と温度の関係について詳しく調べることにした。 2. 実験方法・実験① ㏗ 7.0 の 0.1M リン酸緩衝液に Micrococcus luteus の凍結乾燥粉末を加え、吸光度が 0.9～1.0 の懸濁液（細菌懸濁液）を作製した。リン酸緩衝液を溶媒とし、0.015μM のリゾチーム溶液を作製した。細菌懸濁液 9.675ｍL とリゾチーム溶液 0.325mL を混ぜ、37℃、47℃、 57℃それぞれについて、波長 660nm のもとで濁度の経時的変化を測定した。・実験② リゾチームはヒトでは唾液、涙、鼻水などに含まれている。そこで、実験①のリゾチームを唾液に変え、37℃で同様に実験した。※M.luteus は細菌で、リゾチームの基質である。 3．結果・考察実験 1 実験 2 ・47℃は初速度の値と濁度減少幅が大きかった。57℃は初速度は大きいが、濁度減少幅は小さかった。これは反応途中で失活したと考えた。37℃は初速度は最も小さく、濁度減少幅は 47℃に次いで大きかったので時間をかけて細菌を分解すると考えた。以上より 47℃が最適温度に最も近い温度であったと考えられ、最適温度が 50℃であることをほぼ確認することができた。・37℃の初速度は 47℃の約 80％であった。また、15 分後の濁度減少幅は 47℃の約 50％であった。体温付近では最適温度付近に比べて 50～80％の活性で働くことが示唆される。・唾液の場合、濁度がほぼ横這いか上昇した。唾液中のリゾチーム濃度が低く、加えた唾液量では十分な効果が得られなかったことが考えられる。あるいは、唾液中のリゾチームが正常に働かなかった可能性もあるので条件設定を再検討したい。 4. まとめ・今後の課題・鼻水、涙などでも実験を行う。・M.luteus 以外での身近な細菌を採取し、同様に実験する。・加える唾液量を増やして再度実験を行う。生物６―① マガイニンの生体マップをつくる～アフリカツメガエルの生体防御機構の実態～茗溪学園高等学校佐久間恵吾（2 年）担当教員：鈴木朋子１．目的：アフリカツメガエルのどの場所に一番多くマガイニンが分泌しているかを探る。２．手順: ①アフリカツメガエルの背側 A～X、腹側 A´～X´の位置を決め滅菌した綿棒でこすった。 ②培地にミクロコッカス・ルテウスを培養し、それに ①の綿棒をのせて恒温槽(30℃)に 3 日間入れた。 ③3 日後、シャーレ 1 枚 1 枚を三脚で固定したカメラで撮影し、撮った写真を印刷し培地の透明なところ(阻止円)を切り取り、重さを量った。３．結果写真の重さは D´が 1 番重かった(0.095ｇ)ので、D´を 100 として全て相対値で表した。 A 7 G 8 M 4 S 32 A´ 72 G´ 99 M´ 7 S´ 53 B 25 H 6 N 14 T 0 B´ 79 H´ 40 N´ 37 T´ 31 C 14 I 11 O 11 U 32 C´ 65 I´ 25 O´ 23 U´ 3 D 1 J 14 P 14 V 21 D´ 100 J´ 15 P´ 44 V´ 19 E 21 K 42 Q 13 W 6 E´ 5 K´ 12 Q´ 16 W´ 7 F 13 L 37 R 7 X 35 F´ 33 L´ 0 R´ 2 X´ 14 ４．考察アフリカツメガエルは、全身の皮膚においてマガイニンを分泌している。しかし、分泌量は場所によって異なっている。背側、腹側の阻止円の相対値の平均は、背側 16.2、腹側 33.4 であり、明らかに腹側の方がマガイニンの分泌量が多かった。特に腹の中心の A´B´C´D´が多かった。体の中心に大事な器官が集まっていて、また腹側は周りの石や砂泥などとの接触も多い。最も分泌量の多かった D´は総排出孔に近く、外部からの細菌などの侵入経路になる可能性が高い場所である。よって常に細菌を殺し、傷がついたときにも体の中に細菌が入らないようにしているのだろうと考えられる。これらのことからアフリカツメガエルは、細菌などの侵入のリスクが高い場所により多くのマガイニンを分泌している実態があると考えられる。（参考文献）京都大学大学院薬学研究科.新しい薬をどう創るか.BLUE BACKS,2007. 生物６－② ハーブを用いた抗菌スプレーの作成茨城県立日立第一高等学校滑川はじめに：裕那（２年）安齋正人ハーブと呼ばれている植物にはさまざまな効果・効能があることが知られている。最近，ハーブの抽出液を使った人体に安全な抗菌スプレーの存在を知った。そこで，その抗菌効果に注目し，抗菌効果の強いハーブの抽出液を使えば，より効果が高い抗菌スプレーを作ることができると仮定し研究することにした。目的：抗菌効果の強いハーブの抽出液を使った効果の高い抗菌スプレーを作成するため，ハーブの抗菌効果を調べる。実験方法: 強い抗菌効果があるとされる，コモンセージ（Selvia officinalis），シルバータイム（ Thymus spp. ），レモングラス（ Cymbopogon citrates ），ローズマリー（ Rsmarinus officinalis）を実験材料とする。 ←左からコモンセージ，シルバータイム，レモングラス，ローズマリー＜実験１＞実験に使うハーブに抗菌効果が本当にあるかどうかを調べため，寒天培地に大腸菌懸濁液(LB 液体培地と大腸菌)を展開し，そこにすり潰した実験材料サンプルと，対照実験として石，消しゴムそれぞれ 0.5ｇをのせて，37℃のインキュベーターで 20 時間培養する。＜実験２＞寒天培地を LB 寒天培地にかえて，37℃のインキュベーターで 20 時間培養する。＜実験３＞コロニーのできる過程を見るため，36℃にセットしたヒーターの上に LB 寒天培地を置き，カメラで 10 分おきに撮影する。＜実験４＞市販の精油を用いて，37℃のインキュベーターで 20 時間培養する。また，インキュベーター内で実験３と同様に写真で撮影する。結果・考察：＜実験 1＞全ての寒天培地にコロニーがひとつも見られなかった。栄養源を含まない寒天培地だと，大腸菌は増殖できないと考えられる。＜実験２＞全てのサンプルの周りにコロニーが見られた。栄養源が豊富な条件下では，ハーブの抗菌効果より大腸菌の繁殖する力が勝っているのか，または，ハーブに抗菌効果がないのか，どちらも考えられる。＜実験３＞ヒーターで下から温めたため，シャーレの蓋に結露し詳しく観察できなかった。また，実験１～３ですり潰したハーブは，熱で乾燥してしまった。＜実験４＞タイムの培地には全くコロニーが見られず，セージ，レモングラス，ローズマリーの培地には，サンプルの周りにコロニーが見られなかった。また，コロニーはサンプルから遠いところほど形成されていたのが観察できた。まとめ：実験１～３では，ハーブが乾燥してしまったためか，有用なデータを得られなかった。実験４では，精油を用いたことでサンプルの乾燥を防ぐことができ，セージ，タイム，レモングラス，ローズマリーに抗菌効果がみられた。今後の課題：抗菌効果のある成分の抽出方法などをさらに検討し，最終的に，人体に安全でより効果の高い抗菌スプレーを作成したい。生物６－③ 食品の揮発性物質によるカビの抑制茨城県立水戸第二高等学校鈴木葵（2 年）仙波望美（2 年）高砂知沙（2 年）浜田健志１．はじめに私たちはお弁当に入っている抗菌シートにワサビの成分が入っていることを知り、食品の抗菌効果について興味を持った。そして、お弁当シートは食品に直接触れているため殺菌効果を発揮するとされるが、食品に触れないとどうなのか疑問に思い、この研究を始めた。２．実験目的一般に抗菌効果があるといわれている食品はカビに対する抑制効果があるのか、特に揮発性物質について調べようと思いこの研究を始めた。３．実験方法実験に使用するカビは、餅と白米から採取した 3 種類（Fusarium, Penicillium, Arthrinium）である。はちみつは 2g 測り、はちみつ以外の食品は刻んで乳鉢ですりつぶし、シャーレのふたの内側に置いた。培地に上記にうちの１種類のカビを塗抹し、ふたをして逆さに置き、25 度で培養し、 2 日後に結果を観察した。実験はそれぞれ各カビについて５回行った。４．結果・考察下表の数値はカビの相対面積が対照実験より下回った実験回数を示す。対照実験でのカビの面積を 1.0 としたときの相対面積が５回の実験中４回以上 1.0 を下回る場合は効果あり（下表○）とした。ミントシソショウガはちみつレモン梅干しニンニトウガラクシフザリウム 3 × 4 ○ 5 ○ 4 ○ 4 ○ 5 ○ 5 ○ 0 × ペニシリウム 4 ○ 5 ○ 4 ○ 5 ○ 2 × 5 ○ 5 ○ 0 × 3 × 5 ○ 1 × 4 ○ 1 × 5 ○ 5 ○ 0 × アースリニウムトウガラシ以外の食品にはカビに対する一定の抑制効果が認められた。シソ・はちみつ・梅干し・ニンニクはすべてのカビに抑制効果を示し、特に梅干しとニンニクは高い再現性を示した。ショウガは２種類、ミントとレモンは１種類のカビに対して効果を示した。揮発性物質でカビの増殖を抑制できることから、有効成分を抽出してさらに研究を進めていきたいと考えている。５．今後の課題・揮発成分を抽出して有効成分を分離し、効果を検証する。・研究を重ね、信憑性を高める。生物６―④ 納豆菌が口内環境に与える影響について文京学院大学女子高等学校竹村美帆香（２年），宮下真侑（２年）．．．岩川暢澄背景私たちは細菌に興味を持ち、調べたところ納豆菌の強さについて知った。また、食中毒の原因である病原性大腸菌 O-157 を殺菌したデータにはとても驚いた。納豆菌が他の菌を殺菌できること、納豆菌からできる納豆は食べ物だということから、それを摂取した場合、細菌をたくさん持つ人間にどのような影響があるのかを知りたいと思った。そして一般的に口臭の原因は口内細菌であると知られているので、そこに着目した。目的納豆を食べることで納豆菌が人間の口内の細菌に及ぼす影響について口臭に着目して調べる。方法 ① 納豆を食べる前、食べた後の口臭を 10 分おき 50 分間の変化を計測する。 ② 50 分後の口内を水でゆすぎ細菌を採取し培養する。 ③ 培養した菌に NaOHaq（pH13）を添加し納豆菌以外の菌を取り除く。 ④ 1 日放置した後、納豆菌が残っているか観察する。結果納豆を食べると次第に口臭が減っていった。 NaOHaq を添加した後、納豆菌の存在を確認できた。。考察口臭が減ったこと、NaOH を添加した後菌が残っていたことから納豆菌が口臭の原因となる口内細菌を減らしたのではないかと考えられる。結論納豆菌は口内細菌を減らすことがわかった。これは納豆菌が直接口内細菌に作用しただけではなく、納豆のねばねば成分であるポリグルタミン酸が唾液の分泌を促進し間接系に口臭を減らしたとも考えられる。生物６－⑤ 抗菌効果を探る～大腸菌に対するマヌカハニーの温度効果及び希釈効果～茨城県立緑岡高等学校池田和香奈（２），岩田結里子（２），川﨑裕生（２），田中大夢（２），綿引大介（２），筑内雅明 1 はじめにマヌカハニーには他のハチミツにはない抗菌成分のメチルグリオキサールが含まれている。私達はそのはたらきに着目して，マヌカハニーが最も良く抗菌効果を示す方法を探り，日常生活に役立つ製品を作製する。 2 試料および培地，サンプル試料：大腸菌（NBRC-3301）培地：LB 培地サンプル：ニュージーランド産マヌカハニー（UMF18＋または MGO800＋） 3 実験方法・実験１：温度効果（マヌカハニーはＵＭＦ18+を使用）（１）マイクロピペットで大腸菌懸濁液（LB800μL と大腸菌）を 200μL ずつ滴下し，スプレッダーで大腸菌懸濁液を培地全体に展開する。（２）マヌカハニーの温度は，実験室で再現可能な－20℃から 120℃まで 20℃間隔とする。（３）各温度のマヌカハニーに浸した濾紙をプレートの中央に置き、37℃で一晩培養する。・実験２：希釈効果（マヌカハニーはＭＧＯ800+を使用）（１）マヌカハニーをLBで希釈する。（2，10，20，40，80，100倍希釈）（２）ペーパーディスクに各濃度のマヌカハニーを滴下したものを，大腸菌を広げたプレートに置き，37℃で一晩培養する。実験１：温度効果 4 結果・考察高温になるにつれて効果が小さくなる。低温では効果に差がみられない。 →過酸化水素の影響が考えられる。・40℃を最適温度とする。実験２：希釈効果どの希釈でも効果が現れない。 →マヌカハニーは原液のまま使用した方がよい。その反面，大腸菌の量が多いことや，培地までサンプルが浸透していないことが可能性として挙げられるため，追加実験の必要がある。図１：温度実験結果５今後の課題・実験１と実験２で使用したマヌカハニーのメチルグリオキサールの含有量が異なるため，含有量を揃えて追加実験を行う。・マヌカハニーの特性を利用してハンドソープやうがい薬を作製する。生物６－⑥ 米粉パン～米粉の発酵条件に関する研究～文京学院大学女子高等学校発表者 1 猪股彩瑛(高校 2 年生)，発表者 2 松本美希(高校 2 年生) 担当教員名草薙美生大杉美貴「背景」小麦アレルギーの原因は小麦に含まれているグルテンであり、日本だけではなく全世界の人が悩んでいるアレルギーである。本校ではタイとの交流がありタイ特有の素材を用いた研究をしている。米粉パンはタイにおいて新しいグルテンフリー食品として普及する可能性がある。日本では、小麦アレルギーの人でも食べられる日本米で作ったグルテンフリーの米粉パンがあるが、タイではタイ米を原料とした米粉パンは製造されていない。「目的」日本米(コシヒカリ)・タイ米(インディカ米)で発酵しやすい温度条件を決定する。「方法」コシヒカリとインディカ米の酵母液の入ったキューネ発酵管を 30℃・40℃・50℃に保ち、５分毎に二酸化炭素発生量を計測した。「結果」コシヒカリ・インディカ米において大きな差異は見られなかった。「考察」コシヒカリ、インディカ米について、それぞれの温度での二酸化炭素発生量に大きな違いは見られなかった。40℃と 50℃で大きな差異は見られなかったが、30℃では明らかに二酸化炭素発生量が少なかった。これらのことより、一般的に酵母菌の発酵における最適温度と言われている 40℃付近が米粉においても最適な温度であると言える。「結論」日本米とタイ米の発酵における最適温度を発見することができた。「今後の展望」今後は米粉のアミロース・アミロペクチン含有量を計測し、結果につなげたいと思う。また、小麦グルテンにかわる増粘物質を発見する。生物６－⑦