CELLine フラスコ (BD)を用いた遺伝子組み換え CHO 細胞の培養とタンパク質産生材料と方法培養液： ① 蛋白産生用無血清培地 ② 細胞増殖培地 RITC80・7（プロリン 10 倍に増量） RITC80・7（プロリン 10 倍に増量）＋1%FBS 細胞：ヒト T 遺伝子*を組み込んだ CHO 細胞（CHO-T） *あるタンパク質をコードする遺伝子の略記であり、正式な名称ではありません。培養容器： 225 cm2 の培養フラスコ CELLine フラスコ (BD) 培養方法：１， CHO-T を細胞増殖培地（1%FBS 含有）中で 225 cm2 の培養フラスコ 5 本に増殖させた。２，フラスコに付着増殖しコンフルエントになったところで、トリプシン-EDTA で細胞を分散させた。すべての細胞を遠心分離により回収した。３，すべての細胞（約 2×108 個）を増殖培地 20 mL に懸濁し、細胞浮遊液を調製した。４，培地栄養成分供給チャンバーに無血清 RITC80・7 培地を 1L 注入した後に、細胞培養チャンバーに細胞浮遊液を 20 mL 注入した。５，すべてのキャップを閉じ培養を開始した。組み換えタンパク質の回収：１，培養開始から 7 日ごとに細胞培養チャンバーから細胞浮遊液すべてをピペットで取り出し、1200 rpm、5 分の遠心で培養液と細胞に分離した。２，細胞は再度 20 mL の増殖培地で浮遊懸濁し培養チャンバーに注入、培養上清はタンパク質回収と定量分析のため - 30℃で保存した。３，以上の操作を 3 回繰り返した（3 週続けて培養した）。 T タンパク質定量分析：１，ヒト T タンパク質は抗ヒト T タンパク質抗体を用いた ELISA 法により定量した。２，含有量は精製 T タンパク質を標品として検量線から算出した。結果細胞増殖について： l CELLine フラスコに入れた細胞は、増殖を開始した。3 日以降、凝集塊を形成、細胞数の測定は不可能になった。 l 培養の継続と共に細胞塊は大型化した。（細胞回収時に強いピペッティングを行なうと細胞が破壊されるので注意。）培養 1 日目培養 3 日目 T タンパク質定量結果：試料 1（7 日目）回収液量 18 mL、T タンパク質含量 26.1μg/mL、総回収量 0.47 mg 98.5μg/mL、総回収量 1.67 mg 83.0μg/mL、総回収量 1.41 mg 試料 2（14 日目）回収液量 17 mL、T タンパク質濃度試料 3（21 日目）回収液量 17 mL、T タンパク質濃度 98.5μg/ml 1,800 Ｔタンパク質生産量 μg 1,600 83.0μg/ml 1,400 1,200 1,000 800 26.1μg/ml 600 400 200 0 ７日 14日培養日数 21日まとめ l CHO-T 細胞のフラスコ培養法による、T タンパク質の生産量は約 7.2μg/mL であるから、CELLine フラスコでは 10 倍程度の高濃度生産が可能であった。 l タンパク濃縮操作が不必要なため、培養上清を直接アフィニティークロマトグラフィーにより精製できた。 l 一般的なフラスコ培養法でのタンパク質の回収は 1、2 日毎に培養液の回収を行なう必要があるが、 CELLine フラスコでは 1 週間に 1 回で十分であった。データ提供：株式会社細胞科学研究所