　Kobe University Repository : Kernel Title 分裂酵母モデル系における5-fluorouracil耐性遺伝子の単離 Author(s) 横井, 敦子 Citation 神戸大学医学部紀要=Medical journal of Kobe University, 62(3/4): 137-142 Issue date 2002-03 Resource Type Departmental Bulletin Paper / 紀要論文 Resource Version publisher URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/00317234 Create Date: 2015-01-31 1 3 7 分裂酵母モデル系における 5 -f lu o r o u r a c i l 耐性遺伝子の単離横井敦子神戸大学大学院医学系研究科ゲノム科学講座分子薬理・薬理ゲノム学分野 (指導:久野高義教授) 連絡先:横井敦子神戸大学大学院医学系研究科ゲノム科学講座分子薬理・薬理ゲノム学分野干6 5 0 0 0 1 7 神戸市中央区楠町 7 5 1 電話 0 7 8 ( 3 8 2 ) 5 4 4 1 FAX0 7 8 ( 3 8 2 ) 5 4 5 9 (平成 1 4 年 1月2 8日受付) 問題のひとつとなっている。この抗癌剤耐性という現要約象については現在さまざまな研究がなされており， 5 f l u o r o u r a c i l( 5・FU) 耐性に関連する遺伝子を分 MDR遺伝子などの P -糖蛋白質の関与するもの，ト裂酵母モデル系において同定し，その解析を行った。ポイソメラーゼの関与するもの，すなわち，過剰発現により野生株に 5-FU耐性を与えするもの，アルキル化剤に対するものなど多数の報告る遺伝子を 2種類単離した。ひとつは dUMPの生成が散見される。レドックス系の関与に関与する g l u t a m i n ea m i d o t r a n s f e r a s e(GLMase)， 5 -f l u o r o u r a c i lは現在，種々の悪性腫虜の治療にお c a r b a m o y l p h o s p h a t es y n t h e t a s e(CPSa s e )，a s p a r t a t e t r a n s c a r b a m o y l a s e (ACT a s e ) をコードする既知いて多用される薬剤で，その薬理作用は t h y m i d i n e の遺伝子 u r aJ +であった。もうひとつは S .c e r e v i s i a e を合成する過程において t h y m i d y l a t es y n t h a s eの働きを阻害することで DNAの合成を抑制し，腫虜細胞のFUR4遺伝子と相同性の高い新規遺伝子であった。 -FUに対する薬剤耐の増殖をおさえるものである。 5 f r 2十と名付けた。この新規遺伝子を f 性の出現はしばしば認められ，治療上の問題となるが， f f r 2 +過剰発現による 5FU耐性は培地中への u r a c i lの添加により増その分子メカニズムについては不明なことが多い 1)2)。強されたが， a d e n i n eの添加では変化がなかった。こ本研究では分裂酵母モデル系を用い，過剰発現によ f r 2 +遺伝子が u r a c i lの輸送に関与するの結果から f り野生株に 5 -FU耐性を与える遺伝子を 2種類ことが示唆された。その他，分裂酵母に薬剤耐性を与および f f r 2 +)単離し，その解析を行った。 C f f r l + えるものとして既に報告されているいくつかの遺伝子方法について 5-FU耐性への影響を検討した。その結果，プロテアソームのコンポーネントのひとつをコードす d r遺伝子の過剰発現が 5-FU耐性を与えることるp α l 材料分裂酵母は HM123 ( h -l e u1 )，大腸菌は DH5α が明らかとなった。 a c U 1 6 9 (φ801acZ ム M15)，hsdR17， [ s u p E 4 4，ム l 緒言 r e c A 1，endA1，gryA96，t h i 1，r e 1 A 1 J株を用いた。培地は， YPD (1 % y e a s t e x t r a c t， 2% 抗癌剤を用いた治療において，はじめから化学療法 p o l y p e p t o n e， 1% d e x t r o s e，0.9% a g a r )，EMM3)，に反応しない，あるいは治療の過程において抗癌剤の LB ( 0 . 5 %y e a s te x t r a c t， 1% p o l y p e p t o n e，0.5% 有効性が減少し，次第に癌が進行するといったことは NaCl)を用いた。 5-FUはナカライテスク社製のも臨床的にしばしば認められ，化学療法における重大なのを用いた。 f l u o r o u r a c i l 薬物耐性，キーワード:抗癌薬， 5 トランスポーター，分裂酵母 ( 8 3) 1 3 8 2 過剰発現により 5-FU耐性を与える遺伝子のスク ( a s p a r t a t et r a n s c a r b a m o y l a s e ) をコードすることリーニングが知られている。これらの酵素は酵母から晴乳動物ま分裂酵母野生株 HM123を酢酸リチウム法により出で広く存在するもので，その構造はよく保存されてお芽酵母遺伝子 LEU2を選択マーカーとしてもつ分裂り，その働きは反応生成物である UTPのネガティブ enomicl i b r a r yで形質転換し，約 2 5， 0 0 0コロ酵母の g フィードパックによって調節されている4)0 5 -FUは -FUをニーを得た。レプリカ法により 100μg/mlの 5 dUMPから dTMPを合成する t h y m i d y l a t es y n t h a s e 含む YPD培地上で生育可能な株が 6個単離された。を桔抗的に阻害し細胞増殖の抑制をもたらす。 f f r l + -FU耐性が形質転換に由来するものであるこれらの 5 にコードされている G LNase. C P S a s e . ATCaseはことを確認したのち，プラスミドを単離した。これら dUMPの生成に関与し， UMPは更に u r a c i lと反応のクローンの塩基配列を決定し，推定アミノ酸から相 PSase，ATCase し， UTPが合成され， GLNase，C 同性検索を行い，遺伝子を同定した口は UTPによるネガティブフィードノイックをうけてい f r l +遺伝子を過剰発現した野生株が 5-FUに耐る。 f 結果及び考察性を持つメカニズムとして， t h y m i d y l a t es y n t h a s e の本来の基質である細胞内 dUMP濃度の上昇を引き h y m i d y l a t es y n t h a s eによる反応起こし，その結果 t 1 遺伝子クローニング -FU耐性を与えうる遺伝スクリーニングの結果， 5 -FUによる阻害反応に措抗していを促進することで 5 0.8%) 子を 6クローン単離した。アガロースゲル ( ることが予測される。電気泳動およびサザン解析により，これらは 2種類の遺伝子に分類された。ひとつを f frl¥ 他方を f f r 2 + 2 f f r 2十遺伝子は新規膜タンパク質をコードする。と命名した。これらを更に短縮，サブクローニングし， f f r 2 ナ遺伝子は出芽酵母の u r a c i lt r a n s p o r t e rをコーシークエンスの決定を行った。 YPD培地，および 5-FUを含む YPD培地上での生育を比較したところ，ドする FUR4遺伝子と塩基配列において 47.9%，コー f f r 1 +遺伝子の過剰発現はより高濃度の 5-FUを含む性をもつものであった(図 2)。また， h ydropathy 培地上で生育が可能であった(図 1)。相同性検索の a n a l y s i sの結果， f f r 2 +は 9回膜貫通型の蛋白であり f f r l +は既知の遺伝子 urαrと同ーのものであ plasmamembraneに存在する可能性が最も高いこと結果，ドする遺伝子産物はアミノ酸配列において， 28%相向ることが明らかとなった。がわかった。 ur αrの遺伝子は UTP ( u r i d i n et r i p h o s p h a t e ) -FUをまた，完全合成培地である EMM培地に 5 およびアルギニンの合成経路に関与する複数の酵素 f r l +を多コピーで発現する形質転加えた場合には， f GLNase ( g l u t a m i n ea m i d o t r a n s f e r a s e )， CPSase 換株は発現しない株に比べてよく生育し， YPD培地 ( c a r b a m o y l p h o s p h a t es y n t h e t a s e ) および ATCase -FU耐性を獲得するが， f f r 2 +を多コピーと同様に 5 YPD YPむやふ Fυ(10μg/ml) YPDゃ 5FU(100μg/ml) 醐 r 図 1 ur α 遺伝子および f f r 2 +遺伝子の過剰発現による 5-FU耐性摂氏 3 0度で 3日間培養した後の写真を示す。 (84) 1 3 9 F f r 2 :1 5 S E K N L D V G F G E S S S V D V P V K G R F A S F L K K L E L S S G P E K E N卜岨一一一明DLR58 E + S Sゃ V K+ + + S FK K + + + 1 D い S +仙 F u r 4 :4 3 S Q S N I T T E V Y E A S S 陀E K V S S E K P Q Y S S F W K K I Y Y E Y V V V D K S I L G V S I L D S F M Y N Q D L K1 0 2 札D I I Y L W S C N G I S A S A F R T G T S Y M E M G L S P K Q A L A A L I A G N V F I A M P M T1 1 8 F f r 2 :5 9 P T P P D R R H Y S P + R R+ S + YW +++ + ++ + + G L +Q +GF + + F u r 4 :1 0 3P V E K E R R V W S W Y N Y C Y F W L A E C F N I N T W Q I A A T G L Q L G L N W W Q C W IT I W IG Y G F V G A F V V1 6 2 F f r 2 :1 1 9L N G L F G S H Y H I P F A V Q S R A S F G Y Y F N T L I I L L R F I A G L F Y Y G T N V Y T G A E C V Q T I L Y A I F1 7 8 L G SY H +F+S R A S F G+F+ ++日+ ++ Y YAV+ L+ I F F u r 4 :1 6 3L A S R V G S A Y H L S F P I S S R A S F G I F F S L W P V I N R V V M A I V W Y S V Q A Y I A A T P V S L M L K S I F2 2 2 叶T S D F L I S Y F V Y W V I S F P F H L I R P E Y L Q R F F L I K S I S T Y I A C2 3 5 F f r 2 :1 7 9K S F R S Y K N R L P A D A G + ++仲P G T ゃ ++F+州 SP Fい P 仲 FφK++ A K D L Q D K I P D H F G S P N A T T Y E F M C F F I F W A A S L P F L L V P P H K I R H L F T V K A V L V P F A S2 8 0 F u r 4 :2 2 3G - 胤I F L しC N V G S H V V W D Q P A T V S G R S W S W V F M C A L N S S V A G F S T L A V N V N D F T R Y V K2 9 3 F f r 2 :2 3 6F A FL I ++ + V G+ + S WF +吐 + AF S T ++ ND F 哨 +K F u r 4 :2 8 1F G F L I W A I R R A H G R I A L G S L T D V Q P H G S A F S W A F L R S L M G C M A N F S T M V I N A P D F S R F S K3 4 0 胤I L P L V A A V S A P IG IV S G V A S KI M Y G T A 刷D P L Q I A N N W T F f r 2 :2 9 4H P K T P Y V Q + 岬 p φ 十Q 村+岬 P++ + 仲 φ l 凶 G 引い l φ A + 州 Y G WP し十 φ 仲 GR A しI G I L V T A A G Y 日Y G I N Y W S P し D V L E K F L Q T T Y N K G T R A4 0 0 F u r 4 :3 4 1N P N S A L W S Q L V C I P F L F S I T C ト . 制由由一一踊剛 . 町踊 . . 凶 . F f r 2 :3 4 9A A F F M G L T Y L V S M I A Q N I S D N T V A A A N D L L Y F F P R Y L D I R R X X X X X X X X X X X X X X P W K I L4 0 8 F+ +V ++ N I SN + + + か F P 仲村 I + R P W+ + 札G T N I S A N S L S C G T D M S A I F P K F I N I K R G S L F C A A M A L C I C P W N L M4 5 9 F u r 4 :4 0 1G V F L I S F V F A V A DI D E F Y N P S G1 Y R Y N K L G L N W4 6 4 F f r 2 :4 0 9Q N G T A F L A F L G S L SI F L G P A A GI F V A D K F K N H H K Y +F L++ I F L A G ++ DF Y+ Y + YYN +G + N W F u r 4 :4 6 0A T S S K F T M A L S A Y A I F L S S I A G V V C S D Y F V V R R G Y I K L T H I Y S H Q K G S F Y M Y G N R F G I N W5 1 9 中S I T M P D G V I H L Y Y I G Y F Y S F M T A F L I Y W G L N L V F P5 2 2 F f r 2 :4 6 5R A L I A F L C A C V P L I P G M A M S I N R A LA 吐 C P+ P G + 科 l今日Gゃ L Y Y +Y やや十F Y L F P し A A Y L C G V A P C L P G F IA E V G A P A IK V S D G A 献しY Y し S Y W V G Y G L S F S S Y T A L C Y F F P5 7 8 F u r 4 :5 2 0R A 図2 f f r 2 +遺伝子と出芽酵母 FUR4遺低予の相同性十は性質のよく似たアミノ酸を…はギャッ議伝子産物が細胞膜あり，ないという EMM培地にふFUと同時に u r a c i lを加えたところ加えない培地の 10惜のふFU す~..，..""峠.I，i.k明国.::j;G..}，<，仲宿あった(図 u こ存在する u r a c i lp e r m e a s eで d en o v o合成の際 p y r i m i d i n ep a t h w a yに加え，細胞の必要とする UMP ，UDP ，UTPのために細胞外の u r a c i lを溜ぶこと 5)6)や， f f r 2 +が高い相向 I1が非常に高い選択性をもって u r i d i n e 性を示す FU の輸送に関与していること 6)7l更に h y d r o p a t h y f r 2 +が p l a s m amembraneに親和 a n a l y s i sの結果， f 性が商いことなどより，われわれの単離した f f r 2 +のコードする蛋白も分裂酵母細胞において u r a c i lの膜る形質転換株はほとんどら FU耐性を獲得し 3)。一方， a d e n i n eを加えたものでは変化がなかった。 dUMPの合成経路においては細胞内，細胞外の両方の u r a c i lが使われるが，以上のように 5 F Uを r a c i lを加えることで生宵に差が見られるむ培地に u ことから f f r 2 十の遺伝子産物が細胞外 u r a c i lの膜輸送 f r 2 + に関与していることが示峻おれた。即ち， f より， u r a c i lの細胞外からの取り込みが増加し，その結果，細胞内の u r a c i l濃度が増加することが予想される。この結果， ιFUの利用が減 h y m i d y l a t es y n t h a s eの間寄が弱くなること少し， t 輸送に何らかの関係があると予測される。 3 既知の分裂醗母多剤耐性遺伝子の 5 F U耐性に対する影響次に，分裂酵母において， f 也の種々の薬剤 l こ耐性を与えることが報告されている分裂酵母遺伝子 p α: p r で細胞生育のための条件が改善され，より高い濃度の， pαdr，pmdrおよび bfrr告;多コピーベクターに 5 F Uを合む培地での生育が可能となったと考えられ組み込んだもので野生株を形質転換し，それぞれの遺るO 伝子を過剰発現させた株について f f r 2十遺伝子産物が高い相向性を示す出芽酵母 FUR4 5 F U耐性の有無を調べたところ，pαdr遺伝子を過剰発現した株のみが ( 8 5) 1 4 0 EMM EMMゆか FU(1μg/ml) E械婦やら FU(1μg/ml) 十 a d緑n i n e(10μ g / n ・ 1 1 ) 関3 定制対+ふ FU( 1μg/ml) +u r a c i l( 1 0μ g / m l ) f f r 2 摂氏 3 0 十野生株 l こ5 -FU耐性を与えうることがわかった(岡 4)0 pαdJ +は分裂酵母の必須遺伝子であり，薬剤耐性にはp αp rを介して関与するとされているがペ今回の我々の実験にお r いて p α: p が 5-FU耐性を与えなかったことはp αdJ+が p αp rを介さない経路で 5-FU耐性に関与している可能性を示唆するものであるO 一方，pαdr 遺伝子産物は真核細胞の蛋白質分解においてきわめて重要な役割を果たしているプロテアソーム複合体のサブ‘ユニットであることが明らかにされている 9)。このことは，抗癌剤耐性と叢白質分解機構との間に何らかの関連が存在することを示唆しており，きわめて興味深い。また，消化器系の癌で高頻度に発現している MDR多剤耐性遺伝子のホモログである EMMやら FU( 1 μ g / m l ) EMM+ら FU( 1 μ諺I m l ) +u r a c i l(10μg/ml) pmdr遺伝子および b f r l +連伝子の高発現が ιFUに対する耐性を与えなかった実験結果は，ヒトの癌治療においても MDR多剤耐性遺伝子は ιFU耐性図4 pαdrj 貴伝子の過剰発現は 5-FU耐性を付与する摂氏 3 0度で 3日間培養した後の写真を示す。に関与しない可能性を強く示唆しており，興味深い。本研究は， ( 8 6) ヒトの細胞に極めて近い単細胞 1 4 1 真核生物である分裂酵母が 5 -FU耐性機構の解析にお s e l e c t i v i t yi ni n t r a c e l l u l a rmembranes. J .B i o. l Chem.2 7 5 :2 5 9 3 1 2 5 9 3 8，2 0 0 0 . 8) Shimanuki， M.， Saka， Y .， Yanagida， M.，いてモデル生物として有用であることを示した最初の知見である。今後は，本論文で明らかにされた種々の現象の分子機構を明らかにすることで抗癌剤耐性の克 Toda，T . :A n o v e le s s e n t i a lf i s s i o ny e a s tg e n e 服に貢献していきたい。 p αd l +p o s i t i v e l yr e g u l a t e s pα pr- d e p e n d e n t t r a n s c r i p t i o n and i s i m p l i c a t e d i n t h e また本稿を終えるにあたり，御指導を賜りました久 m a i n t e n a n c eo fchromosome s t r u c t u r e .J .C e l l 野高義教授並びに研究室の皆様方に深謝致します。 S c i，1 0 8 :5 6 9 5 7 9，1 9 9 5 . 文献 9) S p a t a r o，V .，Toda，T .C r a i g，R . ， S e e g e r，M.， D u b i e l， W.， H a r r i s， A .L . ， 1 ) Habara，K . ， A j i k i，T .，Kamigaki，T .，Nakamura， T .，Kuroda，Y . :Highe x p r e s s i o no ft h y m i d y l a t e s y n t h a s el e a d st or e s i s t a n c et o5 f l u o r o u r a c i li n b i l i a r yt r a c tc a r c i n o m ai nv i t r o . JpnJ C a n c e r R e s .，9 2 :1 1 2 7 1 1 3 2，2 0 01 . 2) Fukushima， M.， F u j i o k a， A . ， U c h i d a， J .， Nakagawa， F .， T a k e c h i， T: ， T h y m i d y l a t e s y n t h a s e ( T S ) and r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e (RNR) may b ei n v o l v e di na c q u i r e dr e s i s t a n c e t o 5 f l u o r o u r a c i l ( 5 F U ) i n human c a n c e r 7 :1 6 8 1 x e n o g r a f t si nv i v o . Eur J C a n c e r .，3 1 6 8 7，2 0 01 . 3) M i t c h i s o n，J . M . :P h y s i o l o g i c a la n dc y t o l o g i c a l c h i z o s αc c hαr o m y c e sp o m h e . Meth. methodsf o rS C e l lP h y s i o ， . l4 :1 3 1 1 6 5，1 9 7 0 . 4) L o l l i e r，M.，J a q u e t，L .，N e d e v a，T .，L a c r o u t e， F .，P o t i e r，S .，S o u c i e t，J . L . :Asi nS αc c h αr o m y c e s c e r e v i s i a e， a s p a r t a t e t r a n s c a r b a m o y r a s e i s a s s e m b l e donam u l t i f u n c t i o n a lp r r o t e i ni n c l u ι i n gad i h y d r o o r o t a s e l i k ec r y p t i c dcmain i n S c h i z o s αc c hαr o m y c e sp o m b e .C u r r .G e n e t .， 2 8 : 1 3 81 4 9，1 9 9 5 . 5) Jund，R . ， Weber，E . ， C h e v a l l i e r，M . :Primary 幽 s t r u c t u r eo ft h eu r a c i lt r a n s p o r tp r o t e i no f S αc c hαr o m y c e sc e r e v i s i αe .Eur，J .B i o c h e m .1 7 1 : 4 1 74 2 4，1 9 8 8 . 6) Wagner，R . ， d e-Montigny，J .，d e w e r g i f o s s e， P .，S o u c i e t，J . L .，P o t i e r，S . : ThePRF YBL042 o fSαc c h αr o m y c e s cereVLs~αe e n c o d e s au r i d i n e p e r m i a s e . FEMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s 1 5 9 : 6 9 7 5，1 9 9 8 . 7) V i c k e r s， M.F.， Yao， S . Y .， B a l d w i n， S .A . ， Young，J . D .，C a s s，C .E . :N u c l e o s i d eT r a n s p o r t P r o t e i n so fSαc c hαr o m y c e sc e r e v i s i αe .D e m o n s t r a t i o no fat r a n s p o r t e r(FUI 1 )w i t hh i g hu r i d i n e s e l e c t i v i t y i n plasma membranes and a t r a n s p o r t e r (FUN26) w i t h b r o a d n u c l e o s i d e (87) Norbury， C . : R e s i s t a n c et od i v e r s ed r u g s and u l t r a v i o l e t l i g h tc o n f e r r e d by o v e r e x p r e s s i o no fan o v e l human2 6Sp r o t e a s o m es u b u n i t .J .B i ol .Chem. 2 7 2 :3 0 4 7 0 3 0 4 7 5，1 9 9 7 . 1 4 2 I s o l a t i o no f5-FUr e s i s t a n tg e n eu s i n gaf i s s i o ny e a s tm o d e ls y s t e m . At s u k oYo k o i Summary The r e s i s t a n c et oa n t i t u m o ra g e n t so f t e n become a problem d u r i n gt h et r e a t m e n to f malignantt u m o r s .I np a r t i c u l a r，s i n c e5 f l u o r o u r a c i l( 5 F U )i sf r e q u e n t l yu s e di nt h ec l i n i c a l x p e r i m e n t a l l ye v a l u a t e d5-FUr e s i s t a n c eu s i n gaf i s s i o ny e a s tmodels y s t e m . t r e a t m e n t，wee T h i se x p e r i m e n t a lsystemwasu s e df o rt h ef o l l o w i n gr e a s o n s :f i s s i o ny e a s ti sane u k a r y o t i c nwhichg e n e t i ci n f o r m a t i o ni sw e l lp r e s e r v e d :t h ec e l lc y c l eo ff i s s i o n organisml i k ehuman，i y e a s ti sv e r ys h o r t : and g e n e t i ca n a l y s i sc a nb er a p i d l y performed b e c a u s et h em o l e c u l a r g e n e t i cmethodsa r ew e l le s t a b l i s h e d . I t was p r e v i o u s l yr e p o r t e dt h a t FUR， FCY， and FUI g e n e so fS . ceremSlα ed e v e l o p s o l a t e d 2g e n e st h a t showed r e s i s t a n c et o 5-FU r e s i s t a n c e5 F U .I nt h ep r e s e n ts t u d y，we i n eg e n ewas when o v e r e x p r e s s e di nt h ew i l d t y p ec e l l s . Ast h er e s u l to fhomologys e a r c h，o r e n e，whereast h eo t h e rwasfoundt ob ean o v e lg e n ewhich i d e nt i f i e da st h eknown urα g . ceremswe. We a l s o compared 5-FU r e s i s t a n t i sh i g h l y homologous t ot h e FUR4 g e n eo fS r e v i o u s l yr e p o r t e dt od e v e l o pr e s i s t a n c e when p h e n o t y p e so fs e v e r a lg e n e s， which were p o v e r e x p r e s s e dt ov a r i o u sa n t i t u m o ra g e n t s . ( 8 8)