アプリケーションノート BD 3D スキャフォールド In vitro 培養・解析九州大学大学院歯学研究院口腔常態制御学講座硬組織構造解析学分野檀上敦、山座孝義、田中輝男 1 【イントロダクション】近年、組織工学分野の研究では、組織・臓器の再生を目指し、組織の修復もしくは再生を促進させるための方法の開発が活発に推進されている。組織の再生に必要なものとして、3 つの要素が必要であるといわれている。つまり、第一の要素として、目標とする組織・臓器を構成する細胞、第二の要素として、細胞が増殖・分化して組織を構成するための環境（主にサイトカイン）、第三の要素として、目標とする組織を構成するための足場（スキャフォールド）である。この 3 要素のなかで、スキャフォールドに要求される条件としては、（1）細胞の増殖・分化を誘導し、組織形成・修復を促進すること、（2）生体への親和性が高く in vivo の環境に可能な限り近いこと、（3）無抗原性であること、そして（4）組織の再生・修復終了後、生体内で分解・吸収性を備えていることである。しかしながら、これら全ての要件を満たすスキャフォールドは、現在のところ未開発のままである。今回、我々は、骨組織の再生を研究するため、以下の 3 種類の BD 社スキャフォールドの中からリン酸カルシウムスキャフォールドについて検討した。 1. リン酸カルシウムスキャフォールド骨の主成分であるリン酸カルシウムは、無機物であるため無抗原性である。また、ハイドロキシアパタイトとは異なり、破骨細胞によって吸収可能な材料である。 2. コラーゲンスキャフォールド骨の細胞外マトリックス（ECM）の主成分であるⅠ型コラーゲン線維を主体とした材料である。高い生体親和性と吸収性をもち、組織の成長を促進できる材料である。 3. OPLA スキャフォールド合成ポリマー由来であり、抗原性が全くなく、また吸収性を持つ材料である。現在、骨折治療用のプレートやスクリューに多く使用されている。【原理】 ̶ in vitro 的解析 ̶ 一般的な細胞培養用プレートを用いた骨芽細胞の培養実験において、石灰化像小結節が確認できる培養条件は、αMEM 基礎培地に仔牛血清を添加した培地に、リン酸の供給源として b-グリセロリン酸、Ⅰ型コラーゲン線維合成に必要なビタミン C の供給源としてアスコルビン酸を加えた培養液で増殖・分化させる事である。本研究では、新生仔ラット頭蓋冠由来の骨芽細胞をスキャフォールドに播種する。その後、上記の条件で培養し、細胞の増殖と石灰化組織の形成の有無を確認する。 2 【準備】 ― 実験動物 ― 新生仔（4 日齢）ならびに 6 週齢雄性 Wistar 系ラットは、九動（佐賀）より購入した。 ― 試薬 ― 以下の各試薬を購入した。コラゲナーゼ（新田ゼラチン、大阪）、ディスパーゼ（合同酒精、東京）、仔牛血清（fetal bovine serum；FBS）および、a minimum essential medium (αMEM)、トリプシン（GIBCO、 USA）、 b-グリセロリン酸およびアスコルビン酸（Sigma、 USA）、パラフォルムアルデヒド（Merck、Germany）、グルタールアルデヒドおよびゼラチン（ナカライテスク、京都）、O.C.T.コンパウンド（サクラ、東京）、ペントバルビタール（ソムノペンチル®、共立製薬、東京）、カルセインブルーおよびアリサリンレッドコンプレキソン（Dojindo）、リゴラック 70F および 2004、過酸化ベンゾイル（日新 EM、東京） ― 培養器具 ― 以下の培養器具を購入した。100 mm セルストレーナーおよび、50 ml 遠沈チューブ、100 mm カルチャーディッシュ、96 ウェルマルチプレート（BD Falcon、USA） ― スキャフォールドー BD 3D リン酸カルシウムスキャフォールド主成分：無機リン酸カルシウム平均ポアサイズ：200-400 mm ― 実験装置 ― マイクロカッティングマシン（BS-300CP）（盟和商事、大阪）、蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Axiotech、Germany） 3 【方法】 ― 骨芽細胞様細胞の培養 ― 生後 4 日齢の Wistar 系ラットの頭皮を剥離し、頭蓋骨を無菌的に取り出した。頭蓋骨を 2~3 mm 四方大に細断し、濾過滅菌済 2 ml 0.1%コラゲナーゼおよび 0.2%ディスパーゼ含有 0.01 M phosphate buffered saline（PBS）にて処理した。頭蓋骨 10 個あたり上記の酵素処理液 2 ml を 50 ml 遠沈チューブにいれて、37℃、10 分間、振蕩させた。上清のみを 100 μ m セルストレーナーで濾過した。新しい酵素処理液を添加して、同様の操作を繰り返した。 5 回目の濾過液に 10% FBS 加αMEM を 6 ml 添加し、毎分 2,000 回転で 5 分間遠心した。細胞ペレットを確認し、上清を吸引し、新しい 10% FBS 加 αMEM を 10 ml 添加した。細胞塊を静かにピペッティング後、細胞懸濁液を 100 mm カルチャーディッシュ上へ播種した。培地は、3 日毎に全量交換した。 70~80%のコンフルエント状態まで増殖させた後、0.1%トリプシンおよび 0.02% EDTA で細胞をカルチャーディッシュ上から剥離させ、1 x 106 個/ml に細胞数を調製した。スキャフォールドとその細胞懸濁液 250 ml を 50 ml チューブに加えた。スキャフォールドは、予め 10% FBS 加 αMEM 培養メディウム中で、30 分間インキュベートした。50 ml チューブ中で３時間、37℃で振盪しながら（毎分 50~60 回程度：あまり速すぎるとスキャフォールドを損傷するので注意が必要）インキュベートした。その後、96 ウェルマルチプレートの各ウェルにスキャフォールド 1 個をセットし、10% FBS 加 αMEM に 5 mM b-グリセロリン酸および 50 mg/ml アスコルビン酸を加えた培養液 250 ml を添加して培養を開始した。培地は、3 日毎に全量交換した。 ― in vitro 的解析 ― 培養 7 および 28 日目に、4%パラフォルムアルデヒドおよび 5%グルタールアルデヒド含有 0.1 M phosphate buffer（PB）（pH 7.4）で 10 分間、室温で固定した。5% EDTA および 4%サッカロース含有 0.01 M PB（pH 7.4）で 2~3 日間、4℃で脱灰した。脱灰終了後、20% サッカロース含有 0.1 M PB（pH 7.4）に浸漬し、その後 O.C.T.コンパウンドに包埋し、ドライアイスで充分に冷却したイソペンタン中にて急速凍結した。クリオスタット（Frigocut 2800N、Jung、Austria）で厚さ 10 mm の凍結切片を-20℃で作製した。ゼラチン処理スライドグラス上に切片を載積した。充分に風乾した後、0.5%トルイジン・ブルー染色液で染色した。【結果】 ― in vitro 的解析 ― リン酸カルシウムスキャフォールドでは、培養初期よりスキャフォールドの内部表面上に細胞が接着していた（図 1）。この現象は、培養後期まで観察されたが、明らかな石灰化組織の形成は認められなかった。 4 図 1. 骨芽細胞を培養したリン酸カルシウムスキャフォールド培養 7 日目（a、b）、28 日目（c、d）の凍結切片法による標本。（b、d）（a、c）の拡大像。スキャフォールド外部ならびに内部表面に細胞が接着している（矢印）。しかしながら、培養 28 日目において、明らかな石灰化組織は認められない。トルイジンブルー染色。 Bar = 400 mm（a、c）、200 mm（b、d）。【注意事項】・・スキャフォールドは非常に壊れやすい。特に平均ポアサイズが大きく、硬くもろいリン酸カルシウムスキャフォールドの取り扱いには注意を要する。スキャフォールドは輸送の際に壊れないように、保護のためのスポンジとともに４８穴プレートに入っているが、そのために静電気を帯びていることが多い。保護のスポンジを取り除く際に、裏にスキャフォールドが付着したままになることがある。 5