2006 ( 田辺製薬 ・生化研) ○ 西田卓 生、松前裕明、町田育子ヽ 柴谷武爾 冠血 管拡張剤 として広 く用 い られているジルチアゼ ム等の基本骨格で ある光学活 である光学活性な 性 なベ ンゾチアゼ ピンを簡便 に合成す るため、 そ の鍵合成中間体 微生物還元を利 シフエニル) グリシッド酸メチルエステル( o ) の t r a n s - 3 - ( 4ト-キメ 用 した合 成 法 を検 討 し た。 Me :Me ジ ル チア ゼム (1)の エ 2 - クロロー3 - ( 4 - メトキ シフェニ ル) - 3 - オキソプ ロピオン酸 メチル ステル ーニ ング カルボ ニル基 を不斉還元 して アル コール体 磁) を生成する微 生物 をス クリ 4 じめ多 2 を くの微生物 からは、3 位が1 の配置 したところ、 M u 6 o r a m b i g u u s I F 0 6 7は のアル コール 6 S4 体 2は を持つ アル コール が得 られ たが、T r i c h O d e r m a v r i d e O U T 4、 で理することにより、対応する光 を与えることが分かつた。得られた2 は、N a O M e 処 へと導くことができた。 学活性な§ Me 00Mo 00Me (2■3o…■ 00Me 一 (2■,3S):2 Meい :。。Me e OH (2月 ,3月 )i (2■ anti I sYn ViriJθ OUT 4642 S :F0 6742 υυ cor a177bむ νυ -14- 3 月) t syn ′ aЛ′ Jc力οder171a 丁″ 。。Me OH ・ /.e.e. 56 層 :∫ 44ノ :if:I:: 1 ノ99 sy17(2S,3R): >99 2007 バ ン酵 母還元 における立体選択性 の 制御 (京大化研 ・岡県大保健福祉) 中村 薫〇近藤慎 一 。河合 靖 。中島伸佳 。大野惇吉 バ ン酵 母 は安価 で扱 いやす い生体触 媒 として有機合成 に広 く利用 されている。 これ まで にプロキラルなケ トンの還元例 が多 く報告 されて いるが、必ず しもその立体 選択性 は高 く はな く、よ り広範な応用 のために立体選択 性 の制御 が検討 されてきた:我 々は α―ケ トエ ステル を基質 とし、有機溶媒 中、少量 の水存在下 でバ ン酵母還元 を行 う ことによ り水 中と 比 して(R凛側 にその立体選択 性 を変化 させ ることを報告 した。今回我 々は酵 素 レベルで こ のような立体 選択性 が何故発現 され るのかについて検討 を行 った。 破砕 したバ ン酵母 よ り α一ケ トエス テル還元 に活性 を有す る酵素を単離精製 した。1種 のNADH依 存 の酵 素 と 6種 のN ADPH依 存 の酵素 が確 認 された。NADH依 Yeast alcohol dehydrogenaseOADH)で あ り、NADPH依 存 の酵 素 は 存酵素 の うち、3種 は既知 の β―ケ トエス テル還元酵素であ った。残 りの 3種 のNADPH依 存酵素 は今回新規 に単離精 製 を行 った酵素であ り、 α―ケ トエステル を基質 としβ―ケ トエステル に対す る還元活性 は認め られなかった。 これ まで のパ ン酵 母還元 の結果 か ら基質濃度が重要な因子である こ とが示唆 されて いたので、それぞれの酵素 の動力学的定数な らびに立体選択 性 について測 定 を行 った。結果 を下記の表 に示す。 表 種 々の α―ケ トエステル に対す る各酵素 の動力学定数 1)/立体選択性 κm(mM)/れ 江(S‐ 酵素 Ａ Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｄ Ｅ CH3COC02Et C4H9COC02Et 4.73ノ4.91/98.2(S) 135/29.2/98.2(S) 590/28/97.9(S) 0.434/1.66/>996) 5.06/30.5/93.5(S) 3.92/0.426/94.5(S) 8.40/1.53/90.l lR) 0.142/4.59/88.3c) 5。 72/27:8/31.4(S) 1.03/2.10/93.6c) 27.3/127/83.96) (CH3)2COC02Et 0.265/8.12/>99(R) 79.4/37.0/76.8(R) 44.0/0.67/91.8c) 93.6/121/67.8解 ) ヒ ドロキシエステル を与えるC 酵 素 は他の酵素 と比ベ ミカエ リス ー 高立体選択的 には) 一 メンテ ン定数にm ) が非常 に小 さく低基質濃度であって も十分 に触媒活性 を有す ことが期待 され る。本酵素が有機溶媒 中で の還元 で大 きな寄与を しているもの と推測 され る。 -15- 2008 パ ン酵 母 由来 1-ア セ トキ シー2=ア ル カノ ン還元 酵素 の精製 と同定 (岡 山大工 ) o石 (岡山県大 ・栄養) 原浩二 ・坪井貞夫 0宇 高正 徳 中島伸佳 1、 2-ジ オ ールは様 々な生理 活性天然物および医薬品な どの合成 中間体 と して重要 で ある。光 学活性な 1、 2-ア ルカンジオールの合成法の一つ として 、 1-ヒ ドロキシー2アルカ ノ ンのパ ン酵母還元では (R)体 のジオールが高立体澪択性、高収率で得 られるこ とが知 られている。 1)我々は立体選択性を コン トロールするとい う観 点か ら 1-ア セ トキ シー2-ア ルカ ノンのパ ン酵母還元を行 った結果、反対 の立体配置を有 する (S)体 の 1アセ トキ シ…2-ア ルカノールが高い立体選択性で得 られることを見 い出 し既に報告 してい 2) る。 我 々は、アセ トキシケ トンの還元反応を酵素 レベルで解析するために、パ ン酵母 よ り以 下の方法で 1-ア セ トキシ…2…アルカノン還元酵素を単離精製 した。 パ ン酵母を緩衝液に懸濁させてガラスビーズ とともに振盪破砕 して粗抽出液を得た。そ れを 50%硫 酸ア ンモニ ウム分画、疎水クロマ トグラフィー、陰イオ ン交換 クロマ トグラ フィー、ゲル ろ過法を行 い 4ス テ ップで純粋な酵素へ と精製 した。 その結果、アセ トキシケ トン還元酵素は一種類のみでモノマー酵素であることがわか っ た。その分子量は電気泳動 の結果より3万 6千 と推定された。この酵素 の基質特異性は、 アセ トキシケ トンに対 しては活性があ ったが、 ヒ ドロキシケ トン、クロロケ トン、 γ―ケ ト酸に対 しては還元活性がなか った。 しか し、驚 くことにアセ トキ シケ トン還元 酵素にはアセ トキシケ トンばか りでな く基 質 の分子構造が類似 している β―ケ トエステル に対 して も活性があることが判明 した。 以上 の結果 とイオ ン交換 クロマ トグラフィ での挙動を合わせると、この酵素は京大化 ー 研の大野 ・中村 らが単離 0精 製 したL2酵 素であると考え られる。 3) 1)J.Barry,H.B.Kagan,シЙωお,453(1981) “ 2 ) M u t a k ■■s a k 」 . 0 3 働 物. クκ .,50,647(1991) , S . T s u b o t JЙ シ “ 3)Ko Nakalnura,Y Kawai,No Nakttima,A Ohno,10客 働 ι″.,56,4778(1991) -16- 2009 1 - ア セ トキ シー 2,4-ア ルカンジオ ンのパ ン酵母不斉還元 (岡山大工 )○ 字高正徳 ・水本敏 之 ・坪井貞夫 1-ア セ トキシー2-ア ルカノンが 95∼ 99%eeの 1-ア セ トキシー2-ア ルカノー ルヘバン酵母にようて還元されることはすでに報告 した1)本 研究会でも,こ の基質の還元 )こ れのジケトンである 1-ア セ トキシー2,4酵素の精製 と同定 を報告の予定である′ アルカンジオンがどのように不斉還元 されるかということは,酵 母還元の特徴 を明かにする だけでなく,有 機合成への利用の点からも,興 味がある。 われわれは前回 (第66)日 化秋季年会でその特徴の一端を, 1-ク ロロー2-ア ルカノ ン( 1-ク ロロ‐ 2,4-ア ルカンジオ ン な どの還元 の特徴 と合 わせて 告 警 が, ￨た (意 外 な)実 験結果 を得 た その後,新 規 な 0 R′ メ Ac ＼/° こ こ告 る 。 の で す F報 Timei 4∼ CHs log]D 摯 Rttα Ac Rtt° Tirne,24h 5h R %Vield 0 R襲 メ ＼ /Cl ぼ OAc一 成 遭 0 ツb ee %Yield [α ]D 73 ee 49(4h) QHs 65(4h) -5.5 rJ-CsHz 53(5h) -17.5 n-CaHe 73(4h) 77(5h) -17.4 18 -12.2 83 23 -21.0 91 22 91 31 94 -2115 ９ ８ 54(5h) 718.3 32 38 93 ９ ８ ８ ８ ５ ８ n- C5 H1 1 40(4h) 93 -17.0 d bakerst yeast bili“ IMBY=calcim alginate… … l)M.u鳳 略 To sakai,S.Tsubol,J.Synm.org.Chem.Jpn.,50,647(1991). パン酵母由来 1-ア セ トキシ‐ 2ニ アルカ の 石原浩二、坪井貞夫,宇 高正徳,中 島伸佳 「 ノシ還元酵素の精製 と同定」 -17- 2010 バ ン 酵 母 を用 い る キ ラ ル な トリ フ ル オ ロ メ チ ル ベ ン ジ ル ア ル コ ー ル 合 成 に お け る立 体 制 御 (二 重 大 工 )○ 清水 真 。杉 本 哲 也 ・藤 澤 有 レアル コニル誘導体 は大 きな双極子 モーメ ン トを 1.光学活性 トリフルオ ロメチルベ ンジ′ 持 つ トリフルオ ロメチル基が不斉炭 素 に直結 してお り、パ ラ位 の官能基 の機 能性 を活用 し て 自発分極 が大 きい強誘電性液晶合成 の キラ ルシン トンと して広 範 に応用 で きることが 期 待 で きる。 トリフルオ ロメチルケ トン類 のパ ン酵母還元 は単純 な構造 のケ トンについ て は 行 われてお り、脂肪族 ケ トンでは高 い光学純 度 で相当す る 2級 アル コールが得 られてい る が、芳香族 トリフルオ ロメチルケ トンの場合 には低光学純度 で しか夕す応 す るアル コール が 得 られてお らず基 質特異性 の限界 を示 してい る。本研究 ではパ ラ位 に電子供与性置換 基 を 有す るα,α,"ト リフルオ ロアセ トフェノン誘導体 のパ ン酵母還元 を行 なった ところそれ ぞ れ高 い光学純度及 び収率 でメ寸応 す るアル コール を得 ることが で きることを見 い だ した。 ３ Ｏ ＨＣ ｌ Ｆ Ｃ B a k e r ヽY c a s t Water CF:忌 bR 2.パ ン酵母還元 の原料 である1は アニ リン誘導体 1(R=NHRI)の 場合 はP‐トリルマ グネ シ ウムプ ロマ イ ドに トリフルオ ロ酢酸 を作用 させ トリフルオ ロアセチル化 しメチ ル基 をク ロ ム酸 で酸 化 し、 さらに官能基 変換す ることによ り得 た。 フェノ ール誘導体 1(R=ORり はP ‐ メ トキシ フェニル マ グネ シ ウムプ ロマ イ ドを用 い同様 に トリフ ル オ ロア セチル化 したの ち官能基変換す ることによ り合成 した。パ ン酵母還元 は トリフル オ ロアセチ ルベ ンゼ ン誘 パ ン酵母 5g、サ ツカロー スを加 える条件 で はサ ッカ ロー ス6g、蒸留水 導体 1(lnlmOl)を レ誘導体2を 得 50mlを用 いて行 い、 それぞれ高 い収率 および光学純度 でベ ンジルアル コー ′ ることがで きた。 この還元反応 では酸素および窒素原子上 の置換基 の効果が大 きく、電子 供与性 の置換基 を有す る誘導体 を用 いた場合高 い光学純度 でバ ン酵母還元生成物 を得 る こ とができた。す なわちアニ リン誘導体 の場合 は窒素原子上の置換基 としてアセチル基 を有 する誘導体1(R=NHAc)を 用 い、サ ツカ ロース存在下パ ン酵母還元 をお こな うことによ り 92%ceの光学収率 でベ ンジルアル コールが得 られた 。 一方 フェノール誘導体 では酢酸 エス テル1(R=OAc)の 場合 はケ トンの還元 と同時 にエステルの加水分解 も進行 し、還元生成物 の光学純度 は満足のい くものではなかったが、安息香酸 エステル1(R=OBz)に 変換 し、サ ツ カロースの存在 しない条件 下還元す るこ とによ り91%ceの光 学純度 で還元 生成物 を得 る こ とがで きた。 さらにこれ らのパ ン酵母還元生成 物 は再結 晶 を行 なうことによ り、光学 的 に純粋 にす ることがで きた。 以上 の様 に本研究 では トリフルオロアセ トフェノンのパ ラ位 に種 々の官能基 を導入 した 基質 を用 いる事 によ り基質特 異性 の問題 を解決 し、高い光 学純度 でR体 の アル ゴールが得 られることを明 らかにした。 -18- 2011 リパ ー ゼ を用 い る 不 斉 加 水 分 解 に よ る 光 学 活 性 含 フ ッ素 ス レ オ ニ ン の 合 成 (三重大工 )○ 清水 真 ・横 田哲也 ・藤 澤 有 ハ ロ(4,4-ジ フルオロ、お よび4,4,4‐ 1.リパーゼ を用 いるカロ トリフルオ ロ)‐ 3 水分解 によ り4‐ メ トキシイ ミノ酪酸 エ チルか ら、相当す る アルコール およびアセ タール を 2‐ -アセ トキシ‐ それぞれ高 い光学純度 で得 ることができるこ とを見 いだした。 さらにメ トキシイ ミノ基 を 選択的に還元 す ることによ り、含 フッ素ス レオニ ンおよびアロス レオニ ン誘導体 に導 くこ とができた。 1) ハロ軋 4-ジフルオ ロ、お よび4,4,4‐ 2.リパー ゼの加水分解 に用 い る基質 となる4‐ トリフ エ ハ エ ロ ル1は ルオ ロ)_3‐ セ ミノ る セ シー ア ト酢酸 チル ア トキ 2-メトキシイ 対応す 含 酪酸 チ こ よ り数段階の合成経路 を経 て良好 な収率 で合成 した。 れ らの基質 を用 いて リパーゼに よ る不斉加水分解 を検討 した。反応 はpH7の リ ン酸緩衝溶液‐ ■響混溶液中、 リパーゼ として はリパーゼPS,AY,AK,PPLを 用 いて検討 した結果、 リパーゼPSが 最 も良い結果 を与えた。 すなわちモノクロロ、モノフルオ●およびジフルオ ロ体 ではそれぞれ室温から45℃で加水 アル コール2と 未反応 のR―ア セター ト1が それぞれ96%か ら98% 分解 を行 なうことによ りS‐ 以上の光学純度 で得 られた。 トリフルオ ロ誘導体 ではS‐ アル コー ル2が 82%ccで、 またR ‐ ア セ ター ト1が 90%%eeの 光 学純度 で得 られた。 得 られたS― ア ル コー ル2は それぞれ BH「■響錯体、NaBH4老くLあ るいはH夕 d― Cを用 いメ トキシイミノ基 を還元 す るこ とによ り、含 フ ッ素 ス レオニ ン3あ るいは アロスレオニ ン誘導佃 へ ほぼ光学 的 に純粋 な形 で変 換す ることがで きた。 またR―アセ ター ト1は エ タノール中 C03に よ り加水分解 した後、 同様 な手法 によ り還元 し、含 フッ素 スレオ ■ ン3あ る いはア ロス レオ ニ ン誘導体4へ 変換 することがで きた。 蛉『 単凧 Et %Me c〉2 R=CH2F,CHF2,CF3, H2Cl H0 0 OEt ttOEt n-/oet ttOEt NH2 靴 (夏%3S〉3 3 c2R,3R〉 c2R,3S4 0S,3R>4 以上 の様 に抗菌、抗 ガ ン、抗 ウイ ルス活性 を有す る含 フッ素 ア ミノ酸 で あ るス レオニ ン 誘導体 をリパ ーゼを用 いる速度論的光学分割 によ り光学的 に純粋 な形 で合成 す ることが で きた。 1)M.Shimizu,T.Yokoれ T.FuiisaWa,re"勁edron Asymm.,4,835(1993). -19- 2012 リパ ー ゼ に よ る 含 フ ッ素 ア ル コ ー ル の 鏡 像 体 選 択 的 エ ス テ ル化 (岡山理大理 ・岡大教 育 。京大化研)○ 浜田 博喜 ・船橋 亮 。伊藤 敏幸 ・ 中村 薫 1.光 学活 性 トリフル オ ロアルカ ノールは、強誘電性液 晶材料 の原料 として注 目 されて い る重 要 な化合物 で あ る。 今 回、我 々は有 機溶媒 中 の リパ ーゼ触媒 による ト アルカ ノール類 の鏡像体選択的 リフルオ ロ‐ 2‐ ラ ンス エ ス テ ル化 を利用 して、1,1,1-ト エ ス テル化 を行 なった。 2.ま ず、十数種 の リパ ーゼ をス クリーニ ン グ して活性 の高 い 6種 の リパ ーゼ を H‐ 2‐ ア ル カ ノ ール (CF3CH° 選 び 、 炭 素 鎖 の 異 な る 4種 の トリ フルオ ロ‐ QH2n+1' n=6‐ 9)お よび相当す るアルカ ノールを基 質 と して反応 を行 な った。反応 は ヘ キサ ン 中で、酢 酸 ビニ ル をアセ チル化剤 としモ レキュラ ーシーブ存在下 で酵素 を添加 して 1 40℃)で追 い、 また、反応 で得 られた ア 行 な った。反 応 の 経過 はGC(PEC 25m,100‐ 120° TA 30m,90‐ C)を用 い て ル コー ルお よびアセテ ー トの不斉 収率 は光 学活性 GC(G‐ 測定 した。 来 の リパ ーゼに よる反応 では トリ フルオ ロ メチル体 で 3,Pseudο mοnas cepacfa由 はS体、相 当す るアル カノール体 ではR体 の 、共 に絶対配置の同 じアル コ ールがアセ チル化 される ことがわか った。 この場合 のエ ナ ンチオ選択 性 は トリフルオ ロメチ ル 体 では低 く(Ё=1.5)、 相当す るアルカノ ール体 で は中 ぐらいで あ った(E=9‐15)。 来の リパ ーゼでは トリフルオ ロメチル体 では酢 、相当す る また、andfda rugosa由 アルカノール体 では 鉢 の、共 に絶対配置 の 同 じアル コールが アセチル化 される こ と がわか った 。 この 時 の絶対配置 は上記 の場合 とは逆であ った。 また、 この 場合 の エ ナ ンチオ選 択性 は トリ フルオ ロメチル体 にお いては高 く(E=250)、 相当す るアル カ ノール体 では低か つた(E=1.8)。 ▼ FO(CH」 ё nH S Lipasefrom C. rugosa OH OAc (cH」 clメ o nH 4oA QAc I “メ。ヘ tl -20- CF6 (CH2)nH R 2013 ル リバ ーゼ による加水分解反応 の エ ナ ンチオ選択性 ∫3epa´ "′ ( 岡 山理 大理 ・* 甲南化 工 ) 直 島好伸 ○楽 隆生 、亀沢 誠 き、橘 芳純 °、 拿 大谷武彦 帰 ″物 1 . リ バ ーゼ P S ( ノ 勢 ″物″′S 3 e p a ″ ′l i p a s e , A m a n o ) に よる酵素変換の エ ナ ンチオ 選択性 を調 べ る 目的 で 、脂肪族第 2 級 アル コ ール か ら調製 したアセテ ー ト誘導体 の加水 分解反応 を検 討 した 。 2 . 反 応 は、アセ トン ー水 の混 合溶媒 に リバ ーゼ P S O . 2 g とアセテ ー ト0 . 5 g を加 え、3 0 - 3 5 ℃ で撹 拌 して 行 つた 。2 - アル カ ノ ールや3 ‐アル カ ノ ニルか ら誘導 した飽 和 アセテ ー アル コ ールがそれぞれ9 6 % e e お よび8 0 % e e の 光学純 トl a 、2 a の場合 には、相 当す る( R ) ― 度 で生 成 した。 この 結果 か ら、一般 に2 - アル カ ノ ァル 系 の方 が3 - アル カ ノ ール 系 よ りも エナ ンチ オ 選択性 が 高 い と言 える。 1 ) 不 飽和 ア セテ ー トにつ いて は、殆 どの場合 、対 応 す る飽 和 アセテ ー トよ りも選択性 に優 れて いることが判 明 した。 2 ) 特 に、ア リル型 アル コ ール の アセテ ー ト5 a やプ ロパ ギル型 のアセテ ー ト6 a にお いて は9 7 - 9 8 % e e の ( R ) ― が 得 られ た ( E > 1 0 0 ) 。 また、不 飽和結合 の 位置 がキラル 中心 か ら離れて いる末端 ビニ ル アセテ ー ト7 a 、8 a にお いて も、それぞれの選択性 は飽 和 のアセテ ー トよ りも高 く、光学 アル コ ールが生成 した 。 しか し、不飽和 アセテ ニ ト9 a 、 純 度 8 9 % e e お よび9 2 % e e の ( R ) ― 1 0 a に対 す る リバ ーゼ P S の 選択性 は低 下す る傾 向 が認 め られた。 トリフルオ ロ体 1 l a ぉ よび環 状 アセテ ー ト1 2 a の加水分解 も同様 な低選択性 を示 した。 OAc OAc I CHg(CHz),i 1a n = 10 3a n=5 … Hふ ル 2a n=9 4a n=4 8a C CF3 1)Yo Naoshima, M. Kanezawa, H. Tachibana, Y. Munakata, T. Fuj ita, K. Kihara, and To Raku, ン1 `″θ″. Soc.′ Perkin trans.ノ ′1993, 557. 2 ) 直島 、楽 、亀 沢 、橘 、第 3 7 回 T E A C 講 演 要 旨集 、p . 3 2 3 ( 1 9 9 3 ) -21- 2014 キラルな放線菌 自己調節因子の調製 ‐ 大阪大学工学部応用生物工学科 : 水 野江弘、作 田庄 平、○山 田靖宙 【Fln勺 】 放線 菌では、 自身 の二 次イヽ謝物質生産や形態分化を調節 する自己調節囚 rの 存在 が 知1ら れている。 これ らは特有 のブ タノライ ド骨格 を有 し、Streplomyces′ irginね eの抗 生物質誘 導因子 rgiriac butanolide(VB)類 や、Streptor77yceS sp.FRI-5の 色色素を誘導す る因子 青 ‐ IM-2などが 知 られて いる。本研究 では、 リパ ゼ による光学分割法を用 いて光学活性 な 1∼4を 調製 し、それ らを用 いて、VB―A生 合成経路最終段階における還元酵素の立体4寺 共 性、及びIM-2の絶対構造を決定することを 目的 とする。 呼 俸 ‐ 準 準 【 方法及び結果】 1)光 学分割 リパ ーゼ22種それぞれについて、1を基質 としてBenzene(dry)中 、無水酢酸で反応 させ、 生成 した1:、1についてそれぞれの旋光度を投1定したょその結果、lipaseL-10、 オ リパーゼ 4SDに より光学活性な(― )-1を調製することができた。又、この際得 られた(+)-1'を同酵 素によリブタノ リシスさせることにより光学活性(+)-1を調製することができた。 同様 の 方法により2、3、4、 についても光学分割を行い、それぞれの光学活性体を得た。 祠 (→‐ 1 2)1か らVB―Aへ の変換酵素の立体特異性 光学活性(― )、(す)-1を、VB―A高 生産株Saη″bわ鹿usの無削1胞抽出液中で変換させた と ころ、(‐ )-1が特異的にVB―Aに 変換された。 このことから、VB―A生 合成経路最終段階に (― おける還元酵素は、(3R)‐ 3-hydroxymethyl‐ 2-(5-methブ hexanOゴ )‐ )-4-butanolide,(¨ )-1を 特異的に還元することがわかった。 3)IM-2の 絶対構造の決定 光学活性(― (2R,3R,6R)、 )、(+)-4をそれぞれNaBH4還 元 し4種の光学活性体(2R,3R,6S)、 (2S,3S,6R)、 (2S,3S,6S)‐ IM,2を調製 した。これ らを用いて青色色素誘導活性を測定する ことにより、IM-2は(2R,3R,6R)の 絶対構造であることを決定 した: -22- 2015 リパ ーゼ を用 いる有用 カル ボ ン酸 の 不斉 エス テル化反応 : エ ナ ンチオ選択性 に及ぼす キラル添加物 の 効果 ( 神戸大 発達科学 ・教育 ・甲南 大理 ・) 上 地真一 。○坂本英之 。大場利 彩 ・ 拿 角谷仁 美 ・宮 澤敏 文 < 序 ・実験 > 市 販 のキラル 物 質 を酵素反応 系 に添加す る ことによ つ て、酵 素 の エ ナ ンチオ選 択性 を大 き く向上 させ るこ とが できれ ば 、有機 化学 的 に有用 な手段 とな りうる。今 回、 2 フ ェ ノキ シプ ロ ピォ ン酸類 ( 1 ) 及 び 2 - ( 4 - イ ソブ チル フ ェニ ル ) プ ロピオ ン酸 ( 2 ) を基 質 と して 、 キラル物 質 を添 加 した 有機溶媒 中 ( イ ソプロ ピル エー テルな ど) で リパーゼ (笏 ぬ cy■ i n d r a θ 由来 な ど) を 用 いて不斉 エス テル化 反応 を試 みた。 反応 の進 行 お よび生 成物 エス テル の“ 光学純度 [ e e ( P ) ] はH P L C に よつて測 定 した。 xO(喝 )CHC00H + BuOH Lipase (1) い CHCH2=(二 +BuOH :l100H 〉 :I:〕 Org.Soivent Ch:ral addlive x一 0さ l l。 Bu 。 〈 1)卜 + H20 ( R ・P r e f e r e n c e ) CH3、 CHCH20 -CHC008u 9H3 +H20 C由 3′ (2) ( S - Prelerence) F値 =ln[1-c(1+ee(P))]/1n[1-c(1-ee(P))], c=f,Convn. <結 果 ・考 察 >反 応 溶媒 中にキ ラル 添加物 と して 、 1ネ (+)― カ ンフ ァー また は 1,(―)―カ ン フ ァー を加 え る と、 いずれ の場合 も無添加 系 に比 べ て エ ナ ンチオ選択性 (F値 )が 著 しく向 上 した 。 また 、 1ル (■ )一と1∫ (― )―カ ンフ ァーでは各 々異 な った F値 を示 し、 リパ ーゼ とカ ン フ ァー 分子 との 直接 的 な キラル相互 作用 の 存在 を示 唆す る結果 が 得 られ た 。例 えば、 (1) の 4-エ チル置換体 (X=C2H5)を 基 質 と して用 いた 場合 、 F=24(無 添加); E=27 (R一 体 添加 );F=42(S― 体添 加)と な つた 。 また 、 この キ ラル添 加系 に、 さ らに微量 の 水 を添加す る と F値 は相乗的 に 向上 し、 E=84(S一 体 添加 十微量 の水 )と な った 。 この よ うな S一 カ ンフ ァー によるエ ナ ンチオ選択性 の 向上効果 は 、 (1)の 多 くの誘 導体 に つ い て認 め られ た 。 また 、基 質 と して (1)と は立 体構造 の 異 な る (2)を 用 いて 、 カ ンフ ァー と微量 の水 を添加 した反応 系 で 同様 な エス テル化 を行な つた ところ 、同傾 向 の添加 物 効果 が 明確 に認 め られ た 。 _ 以上 の よ うな実験結果 か ら、観 測 され た エ ナ ンチオ選択性 の 向上 は 、添加 した キラル 分 子 とリパ ーゼ との特 異 的な相 互 作用 に基 づ くリパ ーゼ の鍵穴構造 の変形 な どに起 因す る と考 え られ る 。現 在 、カ ンフ アー によつて 発現 す るエ ナ ンチオ選択性 の 向上 の機構 モ デ ル を検 討 中であ る。 -23- 2016 有機溶 媒 中 リパ ∵ゼ を用 い た シ リル ケテ ン 類 に よるアル コール のア シル 化反応 京都大学 人間 ・環境学研究科 0 小 京都教育大学 理 学科 笹 直、山 本 行 男 沢 田 誠二 トリメチル シ リルケテン (la)は一般 のケテ ンとは 違 い、安定な化合物で あ り多様な反応に利用 されて い る。アル コール 類 のア シル 化剤 として利用 す る場合、Zn12等のルイス酸が従来使用 され て きた。一方、我 々は 有機溶 媒中の リパーゼの反応にお ける既知 のア シル 化剤 とは 大きく構造 の異な る 化合物を求め、酵素 の新機能開発 をもくろんできた:今 回 トリメチルシリ ル ケテ ンが有機溶媒 中で リパーゼの基質 とな りうるか どうかについて興味 を持ち、研究に着手 した。 リパーゼ の種類、反応条件などを検 索 した結果、カ ビ由来 の リパーゼ 、 サイケン100(ナ ガセ生 化学工業株式会社)に 良好な活性を見いだ した。そ こで トリメチルシリルケテンをア シル 化剤 として、サイケン100による多様 なアル コールに対す るア シル 化反応 の適用範 囲を評価 した。 ROH + R12R2siル c=C=0 Lipase 一 RO-9-CH29評 2呼 0 la:Rl=R2=cH3 lb:Rl=R2=c2H5 lc:Rl= =C■3,R2=Ph サイケ ン1 0 0 の触媒作用 によって第一、第 二及び第ニアル コール が トリメ チルシリル ケテ ンに よつて効率良 くア シル 化され、 トリメチルシ リル アセ . チル エステル類を与えた。フ エノ早ル、嵩高いアル コール、 さらにカルボ キシル基 を有す る基 質 も本酵素 によつて高収率でアシル 化 された。 トリエ チルシ リル ケテ ン及びジメチルフ ェニルシリル ケテ ンに よるア シル 化 も本 つ 酵素 によつて触媒 された。 1) Y.Yamamoto,N.Ozasa,and S.Sawada,OCm.Expres,8,305(1993). -24- 2017 の イ ンプ リン ト手 法 を用 い る脂 質 修 飾 リバ ー ゼ の 不 斉 選 択 性 制 御 (東 工大 ・生命理 工 )○ 岡畑 恵雄 ・幡野 明彦 面 を脂 1)当 研 究室 では、酵素 の優 れた特 性 を有機 合成 に利用す るために、酵素表 につい ての研究 を進め て ― 質分 子 で被覆 し、有機溶 媒 に均 に溶解 す る脂質修飾酵素 1)。 これ ま で、 リパ ーゼ な どの加水分解 酵素 に よる不 斉 選択 的ニステル合成 に きた つた。 ついて検討 して きたが、酵素 自身が もつ不斉選択性 を改変す ることは困難 で あ の を つたa。 い 本研 究 では,リパ ーゼにイ ンプリン ト手法 を用 不斉選択性 改変 行 させ、 プリン ト 2)リ パ ーゼ OF 50 mgを pH 7.0,0.01M酢 酸緩衝液 50 mlに溶解 エニルエ タノールな ど)存 在 下 30分 間 基質 で あ るアル コール基質 アナ ログ (R-1‐ウ 0.4 mlを滴下 して、脂質修 セ ン 撹拌 下、糖脂 質 2C12Gb 50 mgを 溶 か したア ト 溶液 ンパ ク含量 は UV,元 素分析 よ 飾 リパ ーゼ を沈殿 と して得 た もの を凍結 乾燥 した。 タ パーゼ は有機溶媒 には あ る こ とが わかつた。 イ ン プリン ト脂質修飾 リ り約 5W%で 均 一に溶解す るが、水 中 には不溶 で あ つた。 エニルエ タノール とラウリ 3)イ ンプリン ト脂質修飾 リパーゼを用 い、 月―,S-1‐フ た ン酸 を用 い て イ ソ オ ク タ ン 溶 媒 中 で 不 斉 エ ス テ ル 合 成 を行 な っ 。 基 質 パーゼ ( V R / V S = 5 . 5 ) 1 - p h e n y l e t h a n o lイ でン プリ ン トされ た酵 素 は、 ネイテ イブ リ ( V R / V S = 1 6 ) に比べ て、非常 に大 きい不斉選択 ゃイ ンプリ ン トして い ない リパ ーゼ 性 ( V R / V S = 7 7 ) を示す よ うにな った。 表 1: 種 々 の方法 によ り調整 したイ ンプ リン ト脂質修飾 リパーゼ と そ の エ ナ ンチ オ選 択 性 幣 響取 亀 五 L__I_… 墜 き 墾1_11_… condition Enzyme 月,s・ ∞酬 H+す 鋭 Y,f,.,r,r"rJj^r, 論 %貫 30醸 1箭 ) 慇 9算 繊 翼弘 爾 』硼穏キ v, / v, +喝 。 … ; Y Okahata and K.lziro,3υ ″.Crlem. 岡畑恵雄 、第 3 回 バ イオ高分 子研 究会予稿集 、 1993年 7月 -25- 2018 界 面 バ イ オ リア ク タ ー に よ る強 毒 性 中鎖 ア ル カ ン酸 の 合 成 〇小 田 忍, 加 藤昭夫 ・ , 松 富直利 ° , 大 田博道 ・・ ( 関西 ベ イ ン ト ・技術研, ・山 口大 ・応用生化, ・・慶応大 ・理 工 ) 【目 的】 親 水 性 担 体 / 疎 水 性 有 機 溶 媒 界 面 に お け る微 生 物 変 換 シス テ ム ( 界 面 バ イ オ リア ク タ ー ) を 利 用 す る と, 反 応 溶 媒 中 の 基 質 お よ び 産 物 の 毒 性 を 回 避 し (1),高 つつ い 成 績 で 加 水 分 解 , エ ス テ ル 化 , 酸 化 お よ び還 元 反 応 を 行 い 得 (2)。 る 本 研 究 で は, こ の 界 面 バ イ オ リア ク タ ー の シス テ ム 化 お よ び 応 用 研 究 の 一 環 と して 強 毒 性 化 合 物 と して 有 名 な 中鎖 ア ル カ ノ ー ル の 酸 化 に よ る オ ク タ ン酸 等 の 中 鎖 ア ル カ ン酸 の 合 成 を 目的 と した 。 【方 法】 寒 天 平 板 型 界 面 バ イ オ リア ク タ ー ( 栄 養 寒 天 平 板 / 聾 デ カ ン ) を 用 い て 1 % の ト オ クタ ノ ー ル を 酸 化 し得 る 微 生 物 を ス ク リ ーニ ン グ した 。 得 られ た 優 秀 株 に つ い て , 寒 天 平 板 型 リア ク タ ー を 用 い て 変 換 条 件 の 最 適 化 を 行 い , ま た , 濾 過 板 ( A D V A N T E C T―O Y O C o . ) お よ び寒 天 被 覆 濾 過 板 を 担 体 とす る 界 面 リア ク タ ー の 構 築 を 図 った 。 さ らに 同 株 を 用 い た デ カ ン酸 の 合 成 も試 み た 。 【結 果】 細 菌 , 放 線 菌 で オ ク タ ン酸 の 蓄 積 を 伴 わ な い ト オ ク タ ノ ー ル の 消 費 が 認 め られ た の に 対 し, 多 くの 酵 母 で オ ク タ ン酸 の 蓄 積 が 認 め られ た 。 そ の 中 よ り rssdchanル :a scLtLιata Vare scュtLιata IF0 10070 を 優 秀 株 と して 選 定 し た ( オ ク タ ン酸 蓄 積 濃 度 8 。l g / 1 , 変 換 収 率 7 3 % ) が , 本 反 応 は寒 天 被 覆 濾 過 板 を 用 い て も進 行 した 。 デ カ ン酸 の 合 成 に つ い て は, そ の 強 毒 性 に もか か わ らず , 振 盪 式 の 寒 天 平 板 型 界 面 バ イ オ リア クタ ー に よ り最 大 3 2 . 5 g / ■ も の 蓄 積 濃 度 を 示 し, ま た , 多 段 式 の 寒 天 被 覆 濾 過 板 型 リア クタ ー を 用 い て 溶 媒 量 2 5 0 m l ま で の ス ケ ール l-Octanol Decane layer lC OT0 n l ::T° ア ッ プ に も成 功 した 。 ６ ５ -26- ６ ５ ＨＨ 鋼 吐臨 ＳＳ Ohta, 3:ο scJ. BjOtgch. β:ο , cham。 Ohta, 3,ο sc」. 8:Otacた 。3:οchan:, 1515-1517 (1992). 2141-2045 (1992). Microbial fil田 2019 加水分解酵素 による糖転移反応 中島 宏 1鈍 賓宗彦 ユニ チカ(株)中央研究所 生化学研究部 糖 の加水分解酵素 として古 くか ら知 られているガラク トシダーゼは1例 え ば孝L糖を基 質 としたとき1ガ ラク トース とグルコー ス を生成す る。 この加 水分解反応 におい て,水 分子 がガラク トシル基 の受容体 である と考 える こ ともで きる。水分子 の 代 わりとな りうる他の受容体 分子 が反応 系 に共存 す ると,ガ ラク トシル基 が それ ら受容体 に転移す る反応 が起 こる。 ガラク トース + グ ル コース 覺 ガラク トシル乳糖 ( ガラク トオ リゴ糖 ) ガラク トシルアスコル ビン酸 ( 安定化 ビタミンC ) 我 々 は1加 水分解反応性 により糖転移反応活性の高 いガ ラク トシダーゼ を 土壌 よリスクリーニ ン グ し,こ れ らを用 いて (1)ビフ イズス因子 としての 活 性 の高 いガ ラ ク トオ リゴ糖 や,(2)結 合様式 の異な るガラク トシル アスコル ビン酸の合成 を行 った。 加水分解反応性 と糖転移反応性 の違 いについての有機化学的な検討や動 力 学 につ い て も興味 が尽 きないが、本報 では1糖 転移生成物 の応用面 での有 用性 に注 目 し,こ れ ら化合物 の合成条件 ,単 離法 ,構 造決定な らびに性 質 についての知見 を報告す る。 -27- 2020 酵素 を用 い る有機合成 =立 体選択的炭素― 炭素結合形成反応 の開発 ― 理研 ○ 嶋 垣 正 之 、佐 藤 浩晃 、 中 田 忠 昨年度 までに、光学活性非糖質有用物質 の合成 を目指 して、酵素を用 いる立体選択 的 炭素=炭素結合形成反応 を基盤 とする研究 を行なって きた。その過程におい て、FDP アル ドラーゼ を用 いる光学活性α―ヒ ドロキシアルデ ヒ ド誘導体 とフルク トース■1,6-二 リン酸 よ り導 いたジヒ ドロキシァセ トンリン酸 (DHAP)2よ り、炭素―炭素結合を形 ベ 成 させ、 2個 の水酸基 を立体選択的に導入 して ンタマイシンのC-9-C-16部、C― ll T C-16部の合成 を完成 させたこと、光学活性d―メ トキシアルデ ヒ ド誘導体 と2の ジアス テレオ面選択的反応を開発 してきたことを述べた。 今回、その知見 を基盤にしてFDPア ル ドラーゼ存在下、容易に異性化 し得 る光学的 に不活性をα―置換アルデ ヒ ドla-ljと 2と のジアステレォ面選択的反応 を検討 した。 その結果、アル ドラーゼ存在下(イ オウを含む la-lhと 2と の反応 では対応す るア ル ドールを全 く与 えなかったが、ク ロル体 li、 ljは 2と ジアステ レオ面選択的反応 を起 こ し、それぞれ単一の成績体 3i(15%)、 3jを 与えた。ところが、両者は複雑 なNMRス ペ ク トルを示 したので、その うち3iを アセ トナイ ド4iと したがやは り、 全 く解析不能であつた。そ こでさらに4iを アセナル化 して 5iと した ところ、NMR スペ ク トルにおいてプロ トンが分離 し、その構造を確認することができた:以 上のよう に してFDPア ル ドラーゼ存在 下、光学的に不活性 なRS―アルデ ヒ ドli、 ljと DHAP2よ り、3個 の立体を規制 して光学活性非糖質有用物質へ導ける3i、 3jに 変換す ることがで きることが半J明した。現在、その立体構造を検討中である。 X L｀ プ Rノ :H。 R― aldehyde Ｒ ０ Ｈ Ｃ Ｘ 言 ⋮ ︿ ￨ OP03H2 1) FDP alddase 2)acid phOSphatasO R OH DHAP 2 o 3: R=n‐C4HO X=Ci (gngbに。m00 ql ■Rl:亀 b is。 鳥尋 X RAcH。 RS‐aldehyde ‖ ￨::斑 li::静 絆饗 1護 lo R=Ph X=SM● ・ ・control:ed pH lrom umetO ume t0 7 Ac20 Me
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