かとうひろあき加藤博明学位の種類薬学博士学位記番号薬博第119号学位授与年月日昭和57年学位授与の要件学位規則第5条研究科専門課程東北大学大学院薬学研究科氏名(本籍) 一3,月25日第1項 (博士課程)薬学位論文題目該当学専攻胆汁酸サルフエートの合成とその分析法に関する研究 (主論文審査委員査) 教授南原利一7一夫教授野教授長副重男哲郎 . 論近年,各文内容要.旨種肝胆道疾患において硫酸抱合型胆汁酸の増量することが見い出.され,生態との関連から注目をあびている。しかしながら,こテルをsolvdysis後 GC-MSにれら胆汁酸sulf就eのグリシンおよびタウリン抱合体を脱抱合させ,得理的意義,病分離定量には,硫酸エスられる遊離型胆汁酸をGC, より測定するという煩雑かつ間接的な方法が広く用いられる。このたや測定填は信顧性に乏しいばかりか,抱合の形式並びに位置に関する生体の情報を喪失するなど分析法として不満な点が少なくない。一方,硫酸抱合は従来胆汁酸の3位本酸基のみとされてきたが,最基にも見られることが示唆されている。さらにsulfotransferaseの基質特異性,多近.7位水酸様性の問題とも関連して抱合の生理的意義に新たな注目がよせら.れるにいたっている。これらのこ.とから胆汁酸sulfateを脱抱合することなく直接定量する.方法の確立がつよく望まれる。これらsulfateの直接分析法の確立を目的とし,まず標品として必要な遊離型,グリシン及びタウリン抱合型cholicacid(C),chenodeoxycholicacid(CDC),deoxychohcacid(DC), urs・dg・・yρh・li・a・id(UDC)・lith㏄h・h・ 30種・さらに・h・1i・a・idのd・hyd… 12rhonosulfate18種 ζ岨餌仙C .)、の3一7鴨 ρ)および・・師(AC)騨および12-m・n・体の3一7一の合成を行なった(Chart1.2)。 Free R4 R=ONa Glyco R=NHCH2COONa Tauro R=NHCHZCHzSOsNa CO-R R3 Rl!' H 11.2 3-Sulfate 7-Sulfate I.CRI=OSO3Na,R2;R3;R4=H CDCRI=OH,R2=OSO3Na,R3=R4謀H DCR1潭OSO3Na,R2=R3FH,R4=OH UDCR1=OH,R3=OSO3Na,R2・=R4=H CDCR1=OSO3Na,R3=R4'=H,R2詔OH CR1=R4=OH,R2=OSO3Na,R3=H UDCR互=OSO3Na,R2=R4≒H,R3=OH 12-Sulfate .DC;艮1蓄OH,耳2rR3rH,R4=OS.Q3Na CR1=OSO3.Na,R2;R4r=qH,R3=H ClR1=R2=」OH,恥 Chart1 _g_ ・=H,R4已OSO3Na ・皿f・㌻・および R 2 2 R ー, COONa O COt3Na 『、R R1/ 1 H ¥Q H 3-Dehyarocholate 7-Dehydrocholate 7-S=R1罵OSO3Na,R2=OH 3-S重R婁=OSO3Na 7.一S.,12-OAc=R1=OSOゴNa 12門S:R五=OH,R2=OSO3Na 12-5:R,=OH 12-5,7-OAc:R,=OAc ,R2=OSO3Na 12-S,3-OAc:R1=・OAc 0 COONa R1/ ＼R 2 H 12-Dehydrocholate 3-S:R,=OSOgNa ,Rz=OH 3-S,7-OAc:R、=OSO3Na ,R2=OAc 7-S:R,=OH,R2=OSO3Na , 7-S,3-OAc:Rl=OAc ,R2謹OSO3Na 『3'了/「 COONa }㌔R2 R1/ H 3-S,7-OAc:R1霊OSO3珂a,R2=OAc,R3=OH 3-S,12-OAc:R1寡OSO3Na,R2=0}LR3=OA6 7-S,3-OAc:RFOAc,R2=OSO3Na,R3=OH` 7rS,12-OAc;R、 ,R2量OH. 3-S,12-OAc=R,=OSOgNa ,R2=OAc 電OH,耳2.=OSO3Na,R3諸OAc 12-S,3-OAc:R1=OAc,R2=OH,R9=OSO豆Na 12-S,7-OAc:R1=OH,R2=OAc,恥=OSO5Na Cha垂t.2 _q_ >Rz=OAc >Rz=OSO3Na ,R2岩OSO3Na ついでこれらの合成標品を用い,高るとともに,分企て,新速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分離条件を検討す離に影響をおよぼす種々の因子について考察を加えた。さらに生体試料への応用をしい前処理法を開発し,胆汁中胆汁酸sulfateを分離定量するとともに,HPLCにおけるクロマドグラフ的挙動にもとずいてそれらの同定を行なった。 1胆汁酸Su工fateの合成 1・13}Sulfateのまず,中にDC.を合成間体とレて疹要な3-monohydroxy体ベンゼン中p一セトン中NaOHIを ⑱ 合成を行なった。すなわち,C,CDC並トルエンスルホン酸の触媒下ギ酸と反応させホルミル化したのち,含用い3倖ホルミル基のみを選択的に除去した。UDCにメチルシリルクロリドと反応させて3-monosilyletherとアセトン中HClでン,タし,7位脱シリル化して3-monohydroxy体ウリン抱合型への誘導はp一ついでこれらの7位 ,目的とする3-sulfateを得た。ウリン抱合体をさきと同様3-tert-butyldimethylsilyletherとついてはN一をアセチル化後NaBH4還 1.312-Sulfateの水解により3位保護基を除去し,目 .プロムコハク酸イミド(NBS)酸元に付して7-monohydroxy体アセチル化を経て7-sulfateをした。的とする7一. 化により得られる7-oxo体に導き,さきと同様硫酸エステル化,脱および7位を部分アセチル化し,12- 合成した。合成まず.,DC,Cをベンゼン中ピリジンー無水酢酸で3位を得た。これらとそのグリシン,タ脱アセチル化し,目 2CholateSulfateの的とする12一帥lfateを】艶hydrqお 2.1Cholate3-Sulfate誘まず,7-DHC3-sulfateの 3-monosulfateにルカリ水解にて保護基をの合成を行なった。すなわち,CDC,UDC, を硫酸エステルに変え,酸得た。Cに -diacetateを導き,アラムを通して精製し間体として必要な7-monohydroxy体 monohydroxy体グリシ合成およびそのグljシン,タ sulfateをブチノゾジ水酸基をアセチル化したのちを得た。これら中間体およびLCのれらをピリジン中クロルスルホン酸と反応させて3-sulfateに 1.27-Sulfateのついてはtert一水アニトロフエニルエステルを用いる活性エステル法によった。こ一挙に除去後AmberliteXAD-2カまず,中びウリン抱合体の12位を硫酸エステル化後, 製した。よびAGet翼誘導体の合成導体の合成合成は,NBS酸部分水解して3-monohydroxy体化により得られるmethyl7-DHC3,12 として導いた。12-DHC3-sulfate ,ついでさきと同様クロルスルホン酸にて .は,methメoholate3,7一一10一嘩acetate のクロム酸酸化により12-o・xo体同様にして3-monosulfateにに,ついでアルカリ水解により3-monohydrρxy体誘導した。また,C3-sulfateのacetyl誘および12.一DHCacetate3-s皿fateのNaBH4還導体の合成 3-DHC7-s.ulfateは,出発物質にmethylcholate3,12-diacetate7-9ulfateをアセチル基の選択的除去,さ -sulfateはcholate7一とし,つ・sulfateのらにクロム酸酸化によ.り合成した。また,12-DHC7 部分アセチル化により ,cholate3-acetate.7-sulfate いでグロム酸酸化により得た。 2.3Cholate12-Sulfate誘導体の合成 7-DHC12一曲lfateは,7rDHCの3位ルホン酸で12-sul石ateに導き,つ水酸基を部分アセチル化後ピリジン中クロルスいでアルカリ処理により製した。つぎに3-DHC12-s皿fa一 teはmethylcholate3,7-diacetate12-sulfateを出発物質に用い,さよ.りcholate7-acetate12-sulfateとをアルカリで処理し, sulfateの3位 3胆導体は得られた7一元により製した。 2.2Cholate7-Sulfate誘用い,3位に変え, し,つ・きと同様部分水解にいでクロム酸酸化により生ずる3-dehydro.体 .目的物を得た。また,cholate3-acetate12-3ulfateはcholate12- を部分アセチル化して製した。汁酸MonosulfateのHPLC 胆汁酸monosulfateめ基の影響を考察し,さおよぼす移動相pHの標品を用い,HPLCに影響を吟味した。その結果胆汁酸sulfateはpH7.5付の低下とともにk,値は増大し,抱れ,7一,12一,3-sulfateの -sulfateのおよび12-sulfateは近で遊離型-,グ合型の溶出順序は逆転した。3一,7一および12-sdfateは性側においてはk'値に差が見ら順に溶出された。また胆汁酸sulfate(とりわけCDCお分離は移動相の塩濃度につよく影響された。以上の結果から,胆一斉分離にな0 .5%炭リシン, ほぽ同じk'植を示した。一方,pH 例外として同様なクロマトグラフ的挙動を示し,酸の3-sulfate)の離}『およぼす置換らに一斉分離の条件を検討した。すなわち,まずcapacityratio(`巌'植)にタウリン抱合型の順に溶出し,3一,7一 DCSulfateをおけるクロマトグラフ的挙動,分よびDC 汁酸3-mono 酸アンモニウ.ム/アセトニトリルが移動相として墨適であることが判明した(Figd)。一 .11一 (a) (b) (c) 2 11 1 67 2 I 孕3 13115 10 8 45 l 9 t 6員 14 9 3 6員ム占1b1う1乞 Time(min) ム合6乏.4ム合1b1セ Time(min)Time(min) Fig.1SeparationofaMixtureof3-SulfatedBileAcids 1=Cholate,2=glycocholate,3=taurocholate,4=chenodeoxycholate, 5=deoxycholate,6=glycochenodeoxycholate,7=glycodeoxycholate, 8=taurochenodeoxycholate,9=taurodeoxycholate,10=lithocholate, 11=glycolithocholate,12=taurolithochoiate,13=ursodeoxycholate, 14=glycoursodeoxヲcholate,15;tauroursodeoxycholate.Condi廿ons:mobile phase(a)0.5%ammoniumcarbonate/乞cetonitri至e.(26:8),2.1m1/宝nin; (b)0.5%ammoniumcarbonate/acetonitrile(20二8),2.Oml/inin;(c) 0.04ｰoammoniumcarbonate/acetonitrile(36:8),1.6ml/min 4胆汁酸MonosulfateのDehydroお最近,oxo基よびAcety1誘を持つ胆汁酸sulfateが導体のHPLC 体液中に.見い出され,ま他と異なるクロマトグラフ的挙動を示すごとから,胆たHPLCに汁酸sUfateのdehydroおについて精査することを試みた。まず,DC12-sulfate,DHC12-Sulfateお acetateをとりあげ,同様pHのと同様の溶出挙動を示し,そ汁酸SulfateのおいてDCsulfateがよびacetyl誘導体よびそれらの影響について考察した。その結果これら誘導体はDC12rsulfate れは12-Sulfateに側鎖カルボン酸がpHの、特有の性質であることが判明した。この現象は胆上昇に伴なって解離し,12位スルホン酸エステルとの間に相互作用が生起するためと考えられる。つぎにDHCSulfateの分離を検討した。これらはいずれのpHに導体ではkl'値が増大し,こおいてもk∫値が近似し,分離困難であったが,acetyl誘れら異性体の相互分離が可能なことが判明した。 5生体試料中胆汁酸SulfateのHPLC 尿,.胆汁,血 liteXAD樹液などの生体試料からの胆汁酸菖ulfateの分離には有機溶媒による抽出法,Amber- 脂による固相抽出法が広く用いられる。胆汁酸Sulfateは _12_ 極性がきわめてつよく,定量的な回収が困難なため,またところ,吸着時のpH,溶胆汁酸6ulfateのず抽出条件について検討した。Amberlite.XAD-2,XAD-4を出剤のアルコール含量およびpHに種類によって溶出パターンが異なり,定ートリッジの使用を試みた。ヒト胆汁を0.5Mリれに通導,水洗後90%エ試料をPHP-1、H-20に画したのち,1%炭ン酸緩衝液(pH7 タノールで溶出したところ優れた成績が得られ,本吸着させ,遊離型,グ酸アンモニウム/70%エ回収された。ヒト胆汁に各種胆汁酸Sulfateをたところ,クよって回収率が変動するばかりか, 量的な回収が困難であった。そこでSep -p詑C18カされた。つぎに疎水性イオン交換ゲルPHP-LH-20を用い胆汁酸sulfateの。0)で希釈し,こ法の有用性が実証分画法を検討した。リシンおよびタウリン抱合型胆汁酸を順次溶出分タノールで溶出するとき胆汁酸sulfateが添加し,以ロセトグラム上妨害ピークは見られず,再ついで閉塞性黄疸減黄処置胆汁について,胆用い定量的に上の前処理を行なったのちHPLCに付し現性,回収率ともに良好な結果を与えた。汁酸sulfa七eをHPLCで分離定量するとともにクロマトグラフ的挙動にもとついてピークの同定を行なった。その結果胆汁中胆汁酸9ulfateはがグリシン並びにタウリン抱合型胆汁酸3-Sulfateで一13一あることが判明した。ほとんど審胆汁酸は,肝査結果胆道疾患において著明に変動し,体の要旨液中レベルは肝機能を鋭敏に反映することから, 病態の解析上信頼度の高い分析法の確立がもとめられている。これらのうち,最ルフェートにっいては,後も重要視されるサ来標品の得難いことが研究の進展上大きな隣路となってきた。一般にサルフェートの分離定量にはsolvolysis後,グリシン並びにタウリン抱合型を脱抱合させ,得られる遊離型胆汁酸を測定する間接的な方法がとられる。そのため定量性に問題があるばかりか,抱式に関する生体の情報を喪失することが難i点とされる。本研究は,胆成し,これらを用いて高速液体クロマトグラ.フィー(HPLC)にると共に,疎合形汁酸サルフェートの標品を合おける溶出挙動を系統的に考察す水性イオン交換ゲルによる分画法と組み合せた直接一斉分析法を開発し,ヒト胆汁への応用を試みたものである。まず,3一,7一 tert一および12一モノサルフェート'30種の合成を企て,ホルミル化,アブチルジメチルシリル化などを駆使して水酸基を適切に保護したのち,ピホン酸を働かせて目的物を得た。また,側鎖のグリシン,タセチル化, リジン中クロルスウリン抱合型への誘導は,p一ニトロフェニルヱステルを用いる活性エステル法によった。さらに溶出挙動を比較するためコール酸3一サルフェートのデヒドロ体およびアセチル体18種ついで,これらの標品を用い,HPLCにを調製した。おける挙動,分離度におよぼす置換基の効果を考察し, 一斉分析の条件を確立した。すなわち,kノ値におよぼす移動相のpH,塩し,カラムに逆相型のSC-02を,移条件であることを見い出した。また,胆示すことに着目し,そ動相に炭酸アンモニウム/ア汁酸12一濃度の効果を系統的に吟味セトニトリルを用いるのが最適サルフェートが異常なクロマトグラフ的挙動をれが側鎖酸性基の解離状態によって生起する相互作用に起因するものと結論した・最後に,ヒト胆汁への適用を試み,生トリッジに通導し,PHP-LH-20にそく性黄だん減黄処置胆汁について,本体試料のクリーンアップ法を検討した。Sep-pakC、8カよって得られるサルフェート画分をHPLCに法を適用したところ,胆ー付したが,閉汁酸サルフェートは,ほとんどがグリシン並びにタウリン抱合型であることが判明した。本論文は,後来未開拓の分野であった胆汁酸サルフェートをとりあげ,新いて逆相モードHPLCにたに合成した標品を用よる一斉分析法を開発し,生体試料への応用を試みたものであり,病析の方法論として役立つところ甚だ大きく,学位論文として十分価値ある内容と認める。一14一態解