1 インテグリンα β1 の機能糖鎖モジュールインテグリンα5β 機能糖鎖モジュールのモジュールの同定 ○伊左治知弥, 川村千尋, 佐藤裕也, 福田友彦, 顧建国東北薬大・分子生体膜研細胞制御学細胞表面に発現するインテグリンは、N-結合型糖鎖の主なキャリアータンパク質である。N-結合型糖鎖の付加は、細胞の伸展やインテグリン α と β サブユニットのアセンブリに不可欠であることが知られる。実際、精製したインテグリン α5β1 を N-glycosidase F で処理すると、α と β サブユニットが解離され、この特異基質であるフィブロネクチン(FN)への接着が阻害される。また、N-結合型糖鎖の構造はインテグリンの活性化を制御する一因であることが知られる。即ち、線維芽細胞を 1-deoxymannojirimycin で α-mannosidase II を阻害すると、ハイマンノース型インテグリン α5β1 が細胞表面に多く発現し、細胞の FN への接着が著しく阻害される。実際、我々は、HeLaS3 細胞に、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ III (GnT-III)を過剰発現することで、インテグリンの糖鎖構造を改変すると、リガンドとの親和性が低下し、インテグリンを介する細胞接着・移動、また、細胞内シグナル伝達が抑制されることを以前に明らかにした。インテグリン α5β1 は α と β サブユニットに、それぞれ 14 カ所と 12 カ所の推定 N-結合型糖鎖付加部位をもつ。個々の糖鎖付加部位に対し N-結合型糖鎖が修飾されるのか、また、それぞれの付加部位がインテグリンの細胞表面の発現や細胞の伸展活性といった本質的機能に関わるのか不明であった。しかし、最近、我々は、α5 鎖の β-propeller ドメインに位置する site3,4,5 の糖鎖がインテグリンの細胞接着や細胞移動といった機能発現に必須であり、site5 が細胞表面の発現に重要である事を報告した。そこで本研究では、インテグリン β1 サブユニットの機能糖鎖部位に注目して検討を行った。部位特異的変異導入法により、インテグリン β1 サブユニットの糖鎖付加部位の Asn を Gln に置換した変異体を作成し、レトロウィルスを用いインテグリン β1 欠損 GE11 細胞に遺伝子導入を行い、変異インテグリンの安定発現株を得た。SDS-PAGE から I-like ドメインの三カ所の糖鎖は β1 鎖の発現、α5 鎖との二量体形成およびサブユニットの成熟化に重要であることが免疫沈降およびメタボリックラベル実験から分かった。種々の糖鎖欠損変異体の FN 上における細胞の伸展活性を比較したところ、I-like ドメインの 3 か所の糖鎖付加部位に変異を導入することで（∆4-6）、細胞の伸展活性は著しく低下したが、逆に I-like ドメインに 3 カ所糖鎖をもつ変異体(S4-6)では細胞の伸展活性を認めた。一方、I-like ドメイン以外部位に糖鎖付加部位をもつ変異体では細胞の伸展活性は認められなかった。さらに、S4-6 は α5 鎖の β-propeller ドメインにそれぞれ 3 カ所および 1 カ所の糖鎖付加部位をもつ S3-5、S5 変異体と二量体を形成することができたが、∆4-6 とこれらの α5 鎖の糖鎖変異体は二量体を形成することができなかった。また、α5 鎖に 3 本、β1 鎖に 3 本のみ N-結合型糖鎖付加を受ける組み換え型インテグリンを精製し活性を検討したところ、野生型と同等のフィブロネクチン結合活性を示した。以上から、インテグリン α5 鎖の β-propeller ドメインおよび β1 鎖の I-like ドメインに付加された糖鎖は機能発現に重要であることが示唆された。 12