インドシアニングリーンに代表される 生体イメージング用近赤外蛍光色素の 蛍光増強および安定化技術 所属 氏名 理研（生命システム研究センター） 神 隆 1 1) 背 景 （目的） • 近赤外蛍光色素の水溶液中での不安定性（色 素の凝集や蛍光消失）の改善 • 近赤外色素の蛍光輝度の改善 • 近赤外生体蛍光イメージングの高感度化 → 血管、リンパ節、癌腫瘍蛍光イメージング 2 近赤外蛍光イメージングの例 （乳がん腫瘍） 明視野 近赤外蛍光(800 nm) 乳がん 乳がん （高輝度発近赤外量子ドットプローブ） 蛍光の量子収率＞20% 3 生体蛍光イメージング用の近赤外色素 QY：2.5 % オキサジン750 (670 ex. / 685 em.) QY：5 % ローダミン800 (680 ex. / 700 em.) QY：2 % インドシニングリーン (ICG) (780 ex. / 820 em.) QY < 1 % (960 ex. / 1200 em.) QY(水中での量子収率） 4 近赤外蛍光色素の一般的な性質 • 水への溶解性が低い 特に生理的緩衝液には溶けにくい • 水中で凝集する（不安定） 共役系が長く、比較的疎水性であるため • 蛍光の量子収率が小さい 水中では時間とともに蛍光輝度が低下する 5 インドシアニングリーン(ICG)の場合 ICG水溶液の蛍光の消失 1 ICGの蛍光強度 １週間経過 ０ 時間 ICG水溶液 の蛍光像 リン酸緩衝生理食塩水溶液 0 0 1 2 3 4 5 6 水溶液調整後の日数 6 2) 従来技術とその問題点 ICG水溶液の安定性、蛍光輝度を改善するた め、ICGをリポソーム、ナノ粒子、高分子ミセル などに封入する方法があるが、 ・試料の調整に手間と時間がかかる ・粒径サイズが大きくなる ・抗体等の生体分子の修飾が難しい などの問題があり、広く利用されるまでには至っ ていない。 7 ICGを安定化、蛍光輝度を増大させるために報 告されている高分子ミセル (例） 1)Poly(styrene-alt-maleic anhydride)- block-poly(stylene) 分 J. Biomed. Opt. 13, 014025 (2008) 子量=21600 2)Pluronic F-127 (poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide), 分子量=12600 Mol. Pharmaceutics. 6, 480 (2009) 3)MPEG-PLA-PA (poly(ethylene glycol)-poly(lactide)poly(β-amino ester), 分子量=4807-8500 Biomaterials. 35, 3467 (2014) 8 3) 新技術の特徴、効果 • ミセルのサイズが小さい（5nm以下）。 • 近赤外蛍光色素の安定性、発光輝度の著しい 改善（水中で１ヶ月以上安定、200％以上の輝 度増大）。 • 添加剤の大量合成が容易で安価で毒性がない 。 • リンパ節、乳がん腫瘍の生体蛍光イメージング への応用が可能。 9 本技術でミセル形成に用いる化合物 1, 3, 5 分子量 < 3000 両親媒性カリックスアレーン 10 ICGのカリックスアレーンミセルへの取り込み 蛍光輝度増大 ミセル ICG 疎水的環境で 安定化 水中では不安定 11 本技術によるICGの蛍光輝度の改善 PBS 溶液 S4-6 無 有 S4-6 無 S4-6： R = C6H13 F. I. 有 [ICG] = 5 µM [S4-6] = 10 mg/mL 12 本技術によるICGの蛍光増強および安定化 ICGの蛍光スペクトル ICGの吸収スペクトル ICG蛍光の時間変化 ICGの量子収率 [ICG] = 1 µM [S4-6] = 10 mg/mL PBS溶液 13 マウス肝臓およびリンパ節のイメージング 本技術 本技術 [ICG] = 5 µM [S4-6] = 10 mg/mL 14 ICGによるリンパ節の検出感度の比較 [ICG] = 5 µM, [S4-6] = 10 mg/mL 15 ICG修飾抗体での蛍光強度の増大効果 抗体へのICG修飾 b) ICG-NHS ICG修飾抗体の蛍光スペクトル Ab: ハーセプチン [Ab]= 1mg/mL [ICG] = 5 µM [S4-6] = 10 mg/mL 16 ヒト乳がん細胞の近赤外蛍光イメージング ICG-Abによる細胞イメージング（830 nm蛍光） Ab: ハーセプチン, [Ab]= 1mg/mL [ICG] = 5 µM, [S4-6] = 10 mg/mL 17 ヒト乳がんの近赤外蛍光イメージングの高感度化 ICG-Abを100 µL尾静脈から注入 F. I. 504 S4-6 (+) S4-6 (+) 358 S4-6 (+) 212 67 S4-6 (-) 0 hr S4-6 (-) 48 hrs S4-6 (-) 72 hrs [Ab]= 1mg/mL、[ICG] = 5 µM, [S4-6] = 10 mg/mLICG 18 ヒト乳がん腫瘍でのICG-Abの蛍光強度の比較 ICG-Ab, S4-6 (+) 肝臓 腎臓 ICG-Ab, S4-6(-) F. I. 肝臓 腎臓 心臓 腫瘍 脾臓 腫瘍 心臓 脾臓 19 4) 想定される用途 • 近赤外蛍光色素（ICG等)水溶液の安定化、 長期保存。 • 近赤外蛍光色素（抗体修飾ICG等）を用い た細胞イメージング。 • 近赤外蛍光色素（ICG等)を用いた生体蛍 光イメージングの高感度化。 20 5) 実用化に向けた課題 • 培養細胞、動物等を対象として本技術を実用 化する場合、近赤外蛍光試薬の溶解液として キット化するなどの工夫が必要。 • ヒトでの応用を目指すには、さらなる体内動態、 細胞毒性、免疫毒性など安全性の評価が必 要。 21 6) 企業への期待 • 蛍光試薬合成、蛍光イメージングの技術を持 つ企業との共同研究を希望。 • 当面は、小動物での蛍光イメージング用近赤 外プローブの蛍光増強剤として実用化してい ただける企業を希望。 • 将来的には、ヒトでの生体近赤外蛍光イメー ジングの実用化を目指す企業との共同研究を 希望。 22 7) 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称 ：カリックスアレーン誘導体 • 出願番号 • 出願人 • 発明者 ：特願2015-063326 ：理化学研究所 ：神 隆 23 8) 本技術に関する論文発表 • 論文題目： Enhancement of aqueous stability and fluorescence brightness of indocyanine green using small calix[4]arene micelles for near-infrared fluorescence imaging •著者名： Takashi Jin, Setsuko Tsuboi, Akihito Komatsuzaki, Yukio Imamura, Yoshinori Muranaka, Takao Sakata, and Hidehiro Yasuda • 雑誌名：Med. Chem. Commun., 2016, DOI: 10.1039/C5MD00580A 24 お問い合わせ先 国立研究開発法人理化学研究所 産業連携本部 知財創出・活用課 越前谷 美智子（エチゼンヤ ミチコ） E-mail:[email protected] TEL:078-306-3436 25
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