疾患遺伝子：病気は遺伝によって決まるのか神奈川歯科大学内科学教授森實敏夫 Toshio Morizane, MD ヒトゲノムHuman Genome DNA二重ラセン AT GC CGAT AT TA  30億塩基対 4つの塩基 A: アデニン T: チミン C: シトシン G: グアニン  約3-4万の遺伝子 TA CG 核水素結合染色体遺伝子の転写 Transcription CCAAT TATAAA Initiation Codon ATG 5‘ Cap Exon GT DNA Intron Termination Codon AG 転写Transcription Exon TAA TAG TGA 3‘ RNA スプライシング Splicing Poly A tail mRNA *核内での反応遺伝子の翻訳 Translation tRNA 3‘ 5‘ mRNA Ribosome Peptide Amino Acid 4つの塩基 A: アデニン U: ウラシル C: シトシン G: グアニン Termination Codon: UAA UAG UGA 遺伝コード Genetic Code 2番目 1番目 U U C A G 3番目 Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Phe, Phenylalanine; Ser, Serine; Tyr, Tyrosine; Cys, Cysteine; Leu, Leucine 遺伝コード Genetic Code 2番目 1番目 C U C A Leu Pro His Leu Pro His Leu Pro Gln Leu Pro Gln G 3番目 Arg U Arg C Arg A Arg G Pro, Proline; His, Histidine; Arg, Arginine; Gln, Glutamine 遺伝コード Genetic Code 2番目 1番目 A U C Ile Thr Ile Thr Ile Thr Met Thr A G 3番目 Asn Ser U Asn Ser C Lys Arg A Lys Arg G Ile, Isoleucine; Thr, Threonine; Asn, Asparagine; Lys, Lysine 遺伝コード Genetic Code 2番目 1番目 G U Val Val Val Val C Ala Ala Ala Ala A G 3番目 Asp Gly U Asp Gly C Glu Gly A Glu Gly G Val, Valine; Ala, Alanine; Glu, Glutamic acid; Gly, Glycine 翻訳後の修飾  糖鎖などの化学基の付加 – リン酸化 – メチル化 – 水酸化 – アセチル化 – カルボキシル化 – N-グリコシル化（複雑な糖） – O-グリコシル化（複雑な糖）  切断蛋白質の分泌や輸送  アミノ酸配列に局在指定シグナルがある  それぞれの場所で細胞を構成し・機能を発揮するミトコンドリアゴルジ装置核膜透過型蛋白小胞小胞体分泌リボゾーム制限酵素 Endonuclease  DNAの特定の塩基配列の部位を切断する酵素 – AluI AGCT – TaqI TCGA – HindIII AAGCTT – EcoRI GAATTC – その他  抽出されたDNAに作用させるとさまざまな長さのDNA断片Segmentが出来る電気泳動 Electrophoresis  制限酵素で切断したDNA断片をアガロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲルで電気泳動するとDNAの長さによって異なる位置に泳動される  ゲルからニトロセルロースフィルターに転写してハイブリダイゼーションによって特定の配列をもつDNAを特定することが出来るハイブリダイゼーション Hybridization  相補的な配列をもつDNAは互いに結合する。短い合成DNA配列に蛍光色素などのプローブを標識してハイブリダイズさせることによって相補的な遺伝子配列の有無を知ることが出来る。 ATGCATGCATGC ATCGAGCTTACGTACGTACGCCGGATTAC サザンブロットSouthern Blot  制限酵素処理して電気泳動し Nitrocellulose MembraneにTransferしたサンプルにHybridizeさせ、特定の塩基配列を探る方法マーカーDNA プローブDNAとハイブリダイズする DNA断片の大きさが分かる制限酵素処理したサンプル Polymerase Chain Reaction （PCR) ポリメラーゼ連鎖反応 mlあたり100分子以下）DNA 断片を増幅して検出することが出来る。  プライマー Primer DNAを用いて特定の遺伝子配列の部分を増幅することが出来る。  抽出したDNAサンプルにプライマーを混合してハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼ（合成酵素)を反応させる→温度を上昇させて反応を止めてDNAを乖離させる→これを繰り返す：n回で2nに増える  極微量の（1 PCR Ｐｒｉｍｅｒ 3‘ 5‘ 1分子Ｐｒｉｍｅｒ 1回目の合成 2分子 2回目の合成 4分子 n回目の合成 2のn乗個 DNA配列決定 DNA Sequencing  Dideoxyシークエンス法 3‘ Adenineで反応を止める 5‘ ddATP (didioxy ATP) dATP dCTP dGTP dTTP* (標識dTTP) ddATP (didioxy ATP) ddCTP ddGTP ddTTP T*GCT*A T*GCT*CGGT*A T*GCT*CGGT*GGCA それぞれを別に混合した反応を行うとさまざまな長さの DNA断片が合成されそれぞれの分子はA,T,G,Cのいずれかで5‘末端が終了している Didioxyシークエンス法  ポリアクリルアミドゲル電気泳動 – DNA鎖の長さで異なる位置にバンドが出る A + - C G T 読み A C G G T G G C T シークエンス判定 T G C C A C C G A DNA Chips (High Density DNA Arrays) •一度に数万個の遺伝子の発現を調べることが出来る。 •変異を検出することが出来る。 •DNA Sequence を調べることが出来る。 DNA chips: Sequential changes in gene expressions in fibroblast Iyer VR, et al: The Transcriptional Program in the Response of Human Fibroblasts to Serum. Science 1999;283:83-7. ヒト疾患遺伝子  Menderian Inheritance in Man（ヒト遺伝子病のカタログ) – 13,761のメンデル形質が登録されている(2002.7．5現在) – 遺伝子と臨床症状は1対1で対応しない  一般的な疾患 – 環境要因 – 複数の遺伝子の組み合わせが複雑に関与  Oligogenic Disorder  Polygenic Disorder 臨床診断と遺伝子診断  臨床症状（自覚症状と他覚症状)の出現頻度が疾患で異なる → 症状の組み合わせパターンで診断する。  疾患に特有の（特異的な)遺伝子の配列が存在する ?→ 遺伝子の配列によって診断する。  いずれも100%の感度・特異度ではない。突然変異の分類欠失 Deletion  挿入 Insertion  1塩基置換  – ミスセンス突然変異：1個のAAが別のAAに置換 – ナンセンス突然変異：1個のAAが終止コドンになる – スプライス部位突然変異：スプライシングのシグナルを出現あるいは消失させる  フレームシフト：欠失、挿入,スプライシングエラーにより生ずる機能獲得性突然変異と疾患疾患遺伝子異常 α1 アンチトリプシン欠損症シャルコー・マリー・トゥース病先天性パラミオトニア骨形成不全 PI 新たな基質の獲得 PMP22 過剰発現 SCN4A COL 2A1 イオンチャンネルが不適切に開く構造異常の多量体慢性骨髄性白血病 BCR-ABL キメラ遺伝子ハンチントン病 HD 未知機能喪失性突然変異と疾患疾患異常 αサラセミア全遺伝子の欠失筋ジストロフィー（デシャンヌ型）一部の遺伝子の欠失筋ジストロフィー（デシャンヌ型女性） X 染色体転座、逆位血友病 A βグロビン突然変異嚢胞性線維症 F8 遺伝子への LINE-1 繰り返し配列の挿入 mRNA レベルの低下をもたらすプロモーターの突然変異 ΔF508 の突然変異による遺伝子産物の不適切な細胞内局在他遺伝子量効果と疾患疾患遺伝子産物正常に対する割合 C1 エラスターゼ 50% 阻害物質 50% マルファン症候フィブリン群無虹彩症 PAX6 タンパク質 50% 血管神経性浮腫 50% 高コレステロー LDL 受容体ル血症シャルコー・マ PMP22 ミエリン 150% リー・トゥースタンパク質病１A 型同じ遺伝子の異常が複数の疾患で認められる遺伝子染色体局在疾患 PAX3 2q35 CFTR 7q31.2 RET 10q11.2 AR Xcen-q22 ワールデンブルグ症候群 1 型歯槽横紋筋肉腫嚢胞性線維症両側輸精管欠損多発性内分泌腺腫症 2A 型多発性内分泌腺腫症 2B 型甲状腺髄様癌ヒルシュスプルング病睾丸女性化症候群脊髄球筋萎縮症染色体数の異常  倍数体 – 3倍体（６９、XXX,XXY,XYY)：全妊娠例の3%、ほとんど死産、生存率ゼロ  異数体 – 常染色体  ナリソミー：相同染色体の1対が欠損、着床前に死亡  モノソミー：1本の染色体が欠如、胚の時期に死亡  トリソミー：1本の過剰染色体がある、通常胚または胎児期に死亡：トリソミー21=ダウン症候群、トリソミー18=エドワード症候群、トリソミー13=Patau症候群 – 性染色体  XXX,XXY,XYY：比較的問題少ない  ４５、X：99%は自然流産、生存者は不妊、知能は平均的ヒトゲノム計画が完成したあと： 2001年以後  臨床診断に遺伝子診断が広く導入されるであろう。  感染症の（病原体の）診断にも遺伝子診断が導入される：病原性,抗菌薬感受性,抗ウイルス薬感受性の判定など  疾患の予防  遺伝子治療 SNP (single nucleotide polymorphism)スニップ、１塩基遺伝子多型性ヒトゲノム30億塩基対の内、99.9％は人類共通  残り、0.1％、すなわち約300万塩基対は個人個人によって異なる  同じ遺伝子の同じ部分を個人個人で比べた場合、1 塩基だけが異なっていることがある  人口の1％以上で異なっている場合、スニップという  スニップが疾患感受性と関係している可能性がある  日本のミレニアムプロジェクト  首相官邸 http://www.kantei.go.jp/ – ミレニアム・プロジェクト（新しい千年紀プロジェクト）について  ミレニアム・ゲノム・プロジェクト発足会合     ヒトゲノム多様性解析プロジェクト（説明者：中村祐輔東京大学教授医科学研究所ヒトゲノム解析センター長）疾患遺伝子プロジェクト（説明者：廣橋説雄国立がんセンター研究所長）発生・分化・再生プロジェクト（説明者：西川伸一京都大学大学院医学研究科教授）イネゲノム・プロジェクト（説明者：桂直樹農林水産省農業生産資源研究所長）