GC-MS/MS による牛肉中の残留農薬一斉分析法の検討内山賢二・中村正規福岡市保健環境研究所保健科学課 Simultaneous Determination Method for Pesticide Residues in Beef by Gas Chromatography with Tandem Mass Spectrometry Kenji UCHIYAMA and Masanori NAKAMURA Health Science Division, Fukuoka City Institute for Hygiene and the Environment 要約 GC-MS/MS による牛肉中の残留農薬一斉分析法を検討し，117 化合物について一律基準濃度（0.01ppm）での妥当性評価試験を実施した．試験溶液は，試料をアセトンおよび n-ヘキサン（1： 2）混液で抽出し，アセトニトリル/n-ヘキサン分配を行い，エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムで精製し調製した．添加回収試験を実施者 2 名で 2 併行 3 日間行い，厚生労働省より示された「食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン」の各性能パラメーター（選択性・真度・精度・定量限界）を評価した結果，117 化合物のうち 4 化合物で真度が目標値に適合しなかったが，113 化合物においてすべての目標値に適合した．従って本分析法は牛肉中の残留農薬分析法として有用であると考える． Key Wor ds：ガスクロマトグラフ・タンデム型質量分析計 determination，残留農薬１ GC-MS/MS，一斉分析 simultaneous pesticide residue はじめに検討した．平成 22 年 12 月に「食品中に残留する農薬等に関する平成 18 年 5 月 29 日に食品中に残留する農薬等のポジ試験法の妥当性評価ガイドラインについて」が改正されティブリスト制度が導入され，畜水産物においても新た２）に多くの農薬等について暫定基準が設定された．これにめに使用される試験法は，このガイドラインの基準に適１）伴い，厚生労働省は分析法を通知し，「GC/MS によ（以下，ガイドライン），食品規格への適合判定のた合していることが求められる．る農薬等の一斉試験法（畜水産物）」（以下，通知法）そこで，検討した試験法について，ガイドラインに従が示された．通知法では，抽出液をゲル浸透クロマトグって 117 化合物を対象に一律基準濃度での妥当性評価もラフィー（以下，GPC）で食品中の脂肪分を除去（以下，行ったので報告する．脱脂）することとなっている．しかし GPC による精製は２多検体を同時並行で処理することができないため，処理実験方法に長時間を要する等の問題がある．今回，脱脂方法として，GPC の代わりに多検体同時処 2.1 理が可能なアセトニトリル/n-ヘキサン分配を用い，測定に GC-MS/MS を用いた牛肉中の残留農薬一斉分析法を - 110 - 試料福岡市内で市販されていた牛肉（牛の筋肉）を用いた． 2.2 試薬等加え振とうし，静置した後，アセトニトリル層を合わせ標準品：和光純薬工業（株），林純薬工業（株），た．これを減圧下で濃縮し乾固させ，アセトンおよび n- Dr.Ehrenstorfer GmbH 社，Riedel de Haën 社製残留農薬分ヘキサン（1：1）混液 2mL に溶解した後，全量を PSA 析用を用いた．ミニカラムに負荷し，同じ溶液 20mL で溶出した．溶出標準原液：各標準品を 1000mg/L となるようにアセトンに溶解し調製した．液を減圧下で濃縮し乾固させ，アセトンおよび n-ヘキサン（1：1）混液 2mL に溶解し試験溶液とした．標準溶液：標準原液を混合し，1mg/L となるようにアセトンで調製後，さらにアセトンおよび n-ヘキサン（1:1） 2.6 添加回収試験（妥当性評価） 117 化合物について，一律基準濃度（0.01ppm）での添混液で適宜希釈して使用した．エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲル加回収試験を実施者 2 名で 2 併行 3 日間行い，ガイドラ（PSA）ミニカラム：VARIAN 社製 BOND ELUT LRC-PSA インに従い選択性・真度・精度（併行精度・室内精度）・（500mg/3mL）をアセトンおよび n-ヘキサン（1：1）混定量限界を評価した．液 10mL でコンディショニングし使用した．ろ紙：アドバンテック東洋(株)製ろ紙 5A を使用した．３その他の試薬：残留農薬試験用を使用した． 2.3 装置 3.1 ガスクロマトグラフ：Varian 社製 CP-3800 結果 GCMS/MS 条件の検討各化合物の 10mg/L 標準溶液を電子イオン化（EI）に質量分析計（MS/MS）：Varian 社製 1200 より SCAN モードで測定し，強度が高いイオンをプリカホモジナイザー：Kinematica 社製 PT-MR 3100 ーサーイオン（Q1）とした．PRODUCT SCAN モードでコリジョンエネルギーを変化させ，1mg/L とした各化合 2.4 測定条件 2.4.1 ガスクロマトグラフ物の標準溶液を測定し，相対的に最も感度が高かったプロダクトイオン（Q3）をモニターイオンとした．測定条既報３）,４）に基づき次のとおりとした．件を表 1 に示した．各化合物の検量線は 0.01∼0.1µg/mL カラム：J&W Scientific 社製 DB-5MS（0.25mm i.d.× の濃度で相関係数は 0.986 以上と良好な直線性を示した． 30m, 0.25 m）カラム温度：50℃（1min）−25℃/min−125℃（0min） 3.2 アセトニトリル/nヘキサン分配の検討試料の抽出液をアセトニトリル/nヘキサン分配し，ア −10℃/min−300℃（10min）キャリアーガス流量：1mL/min（ヘリウム）セトニトリル層を減圧濃縮し，窒素パージで乾固させ，注入口温度：250℃ ，注入量：2µL（スプリットレス）残渣を目視で確認したところ，脂肪分は確認されなかっ 2.4.2 質量分析計た．また，添加回収試験において，ほとんどの化合物でイオン化モード：EI（70 eV），イオン化電流：50µA 良好な結果が得られたことから，アセトニトリル/nヘキイオン源温度：225℃ ，インターフェース温度：250℃ サン分配による脱脂は GPC の代替法として適用可能でその他の条件：表 1 のとおりあった． 2.5 試験溶液の調製試料 20g に水 20mL，アセトンおよび n-ヘキサン（1： 3.3 添加回収試験（妥当性評価） 3.3.1 選択性および定量限界 2 ）混液 100mL を加えホモジナイズし，遠心分離ブランク試料を測定したところ，すべての化合物にお（2500rpm，5min）した後，有機層をろ過した．残留物いて定量を妨害するようなピークはみられず，選択性のに n-ヘキサン 50mL を加え，再度ホモジナイズし遠心分条件を満足するものであった．添加回収試料（0.01ppm）離を行い，有機層をろ過し，ろ液を合わせ無水硫酸ナトのクロマトグラムから S/N を求めたところ，すべての化リウムで脱水後，n-ヘキサンで 200mL に定容した．その合物において S/N≧10 であったため，定量限界を 0.01ppm うち 50mL を減圧濃縮し，窒素パージで乾固させ，残渣と設定した．を秤量し粗脂肪量とした．これを n-ヘキサン 20mL に溶 3.3.2 真度および精度解，n-ヘキサン飽和アセトニトリル 30mL を加え振とう結果を表 2 に示した．117 化合物のうち 4 化合物（アし，静置した．アセトニトリル層を分取し，残った n-ヘルドリン，フェンスルホチオン，ピラクロホス，シフルキサン層に再度 n-ヘキサン飽和アセトニトリル 30mL をトリン）が真度において目標値である 70∼120％に適合 - 111 - しなかったが，その他 113 化合物についてはすべての目スルホン体に酸化されるため５）真度が低下したと考えら標値（真度：70∼120％，併行精度：RSD％＜25，室内精れた． 120％を超過したピラクロホスおよびシフルトリン度：RSD％＜30）に適合した．真度が適合しなかった主は，試料成分のマトリックス効果（試料成分が対象化合な理由として，アルドリンは脂溶性が高くアセトニトリ物の測定値に影響を与える現象）により GC-MS/MS でのル/n-ヘキサン分配においてアセトニトリル層に十分に測定値が増強されたためと考えられた．移行しなかったため，またフェンスルホチオンは容易に表1 No. 化合物名 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 ※1 イソプロカルブフェノブカルブエトプロホスクロルプロファムトリフルラリンベンダイオカルブペンシクロン α−BHC チオメトンデスメディファムトリフルミゾール代謝物 β−BHC γ−BHC テルブホスダイアジノンピリメタニルターバジルテフルトリン δ−BHC ピリミカルブジメテナミドクロルピリホスメチルパラチオンメチルアラクロールトルクロホスメチルシメトリンヘプタクロルピリミホスメチルフェニトロチオンマラチオンエスプロカルブメトラクロールクロルピリホスジエトフェンカルブチオベンカルブジメチルビンホスシアナジンフェンチオンアルドリンパラチオンテトラコナゾールホスチアゼートペンディメタリンシプロジニルフィプロニルペンコナゾールイソフェンホスピリフェノックス(Z) ヘプタクロルエポキシドフェントエートジクロシメットキナルホスプロシミドントリフルミゾールピリフェノックス(E) op`-DDE ブタクロールパクロブトラゾールブタミホス各化合物の測定条件測定条件 Q1(m/z) Q3(m/z) 121 150 158 213 306 166 180 219 246 181 201 219 219 231 179 198 161 177 219 166 230 286 263 160 265 213 237 290 277 173 222 162 314 225 257 295 225 278 263 291 336 195 252 224 367 248 213 262 353 274 277 157 283 206 262 246 176 236 286 77 121 114 171 264 151 125 145 88 122 136 145 145 175 121 118 88 127 145 71 154 241 109 132 250 170 143 125 109 99 91 133 258 168 100 109 189 109 193 109 128 103 162 118 213 192 185 200 263 246 221 102 96 179 200 176 147 125 202 CE（ｅＶ） ※1 -20 -15 -10 -10 -15 -10 -25 -20 -10 -15 -25 -20 -20 -15 -30 -40 -25 -15 -20 -25 -20 -30 -10 -11 -25 -15 -35 -20 -15 -15 -10 -11 -15 -15 -10 -20 -20 -25 -30 -10 -25 -10 -10 -40 -25 -20 -10 -20 -15 -10 -15 -10 -15 -15 -20 -25 -11 -10 -10 CE：Collision energy - 112 - No. 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 化合物名フルトラニルフルジオキソニルヘキサコナゾールプロチオホスプレチラクロールチフルザミド pp`-DDE ウニコナゾールＰミクロブタニルクレソキシムメチルフルシラゾール op`-DDD ディルドリンシプロコナゾールフェノキサニルエンドリンピリミノバックメチル(Z) クロルベンジレートフェンスルホチオン pp`-DDD op`-DDT メプロニルトリアゾホスエディフェンホスピリミノバックメチル(E) ピラフルフェンエチルレナシルプロピコナゾール pp`-DDT ジフルフェニカンテブコナゾールピリブチカルブビフェントリンエトキサゾールフェンプロパトリンビフェノックスホサロンシハロホップブチルメフェナセットシハロトリンアクリナトリンフェナリモルピラクロホス cis-ペルメトリン trans-ペルメトリンピリダベンカフェンストロールシフルトリンハルフェンプロックスボスカリドフルシトリネートシペルメトリンピリミジフェンフルミオキサジンフェンバレレートフルバリネートジフェノコナゾールデルタメトリン測定条件 Q1(m/z) Q3(m/z) CE（ｅＶ） ※1 173 248 175 309 162 194 246 234 179 206 233 235 263 222 189 281 302 251 293 235 235 269 161 173 302 412 153 259 235 266 250 165 181 300 181 341 182 256 192 197 289 139 360 163 163 309 100 163 263 342 199 163 184 354 167 250 323 253 145 154 111 239 132 166 176 137 152 116 165 165 193 82 125 209 256 139 125 165 165 119 106 108 256 349 136 191 165 218 125 108 166 270 152 310 111 91 136 141 93 111 194 127 127 147 72 91 129 140 157 127 169 326 125 200 265 172 -11 -20 -20 -15 -15 -10 -25 -20 -10 -7 -20 -25 -30 -15 -15 -20 -15 -20 -12 -25 -25 -10 -15 -15 -15 -12 -11 -10 -25 -30 -15 -10 -10 -20 -11 -11 -11 -15 -10 -5 -10 -25 -10 -25 -25 -15 -10 -15 -25 -15 -10 -10 -30 -15 -15 -25 -20 -10 表2 真度併行精度 ※3 室内精度 ※4 化合物名※1 No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 ※2 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * イソプロカルブフェノブカルブエトプロホスクロルプロファムトリフルラリンベンダイオカルブペンシクロン α−BHC チオメトンデスメディファムトリフルミゾール代謝物 β−BHC γ−BHC テルブホスダイアジノンピリメタニルターバジルテフルトリン δ−BHC ピリミカルブジメテナミドクロルピリホスメチルパラチオンメチルアラクロールトルクロホスメチルシメトリンヘプタクロルピリミホスメチルフェニトロチオンマラチオンエスプロカルブメトラクロールクロルピリホスジエトフェンカルブチオベンカルブジメチルビンホスシアナジンフェンチオンアルドリンパラチオンテトラコナゾールホスチアゼートペンディメタリンシプロジニルフィプロニルペンコナゾールイソフェンホスピリフェノックス(Z) ヘプタクロルエポキシドフェントエートジクロシメットキナルホスプロシミドントリフルミゾールピリフェノックス(E) op`-DDE ブタクロールパクロブトラゾールブタミホス添加回収試験結果評価（％）（RSD％) （RSD％）結果 90 87 92 97 89 71 106 85 93 103 100 90 86 91 91 97 78 90 88 82 95 100 98 98 94 88 78 94 99 95 85 94 89 91 90 90 70 94 53 105 103 76 85 94 96 101 97 102 89 100 95 98 99 117 107 79 91 108 97 6.9 6.6 7.0 5.9 10.1 7.8 9.4 6.0 8.5 17.6 6.7 7.9 8.4 6.8 7.4 6.4 10.7 3.7 4.1 7.8 4.6 8.8 6.1 6.9 5.7 6.7 13.7 3.4 8.8 3.3 5.3 3.2 6.3 5.5 5.1 3.2 12.5 5.6 5.3 8.4 8.8 4.4 5.7 3.9 9.6 4.0 5.9 6.6 4.4 6.5 6.3 5.3 3.7 14.5 13.8 4.6 9.8 4.8 3.9 9.7 9.0 9.5 9.4 13.2 13.5 11.4 11.1 15.6 28.0 9.0 9.6 9.0 11.8 11.3 9.4 22.4 7.2 12.3 11.6 7.3 9.3 9.2 9.1 9.9 12.3 19.6 9.5 11.2 8.7 6.5 8.0 6.4 10.9 8.4 9.3 13.4 8.4 12.3 11.3 12.8 12.4 8.7 10.3 12.9 15.7 7.8 13.4 8.0 10.8 11.5 7.4 8.3 17.9 19.7 7.4 10.0 11.0 10.1 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 ※1 *のついた化合物は牛の筋肉の基準値が 0.01ppm（一律基準含む）のもの． ※2 添加濃度 0.01ppm における真度の目標値 70∼120％ ※3 添加濃度 0.01ppm における併行精度の目標値 RSD％＜25 ※4 添加濃度 0.01ppm における室内精度の目標値 RSD％＜30 - 113 - 真度 ※2 併行精度 ※3 室内精度※4 評価（％）（RSD％) （RSD％）結果 108 95 106 85 93 99 73 117 101 96 92 81 86 100 99 86 93 97 68 86 85 106 109 106 101 100 78 108 109 103 110 102 94 103 120 116 115 114 114 112 110 109 124 115 111 99 113 124 98 104 115 111 112 86 113 117 105 108 6.2 7.4 8.8 4.2 4.8 5.0 3.3 4.7 8.6 5.4 9.9 6.3 13.9 9.7 6.3 23.5 7.8 5.9 10.3 6.8 6.1 4.3 11.0 8.6 6.8 7.3 5.9 5.3 4.3 6.8 7.4 5.4 5.5 4.9 6.0 9.0 5.7 5.6 4.9 7.1 6.3 8.6 12.3 5.5 6.8 5.3 5.6 3.9 7.1 4.8 4.4 6.9 6.7 3.7 6.2 7.0 4.7 6.1 10.8 10.0 13.9 6.9 6.8 9.4 5.2 10.1 9.8 10.0 23.1 7.4 17.2 14.2 9.4 22.0 10.8 9.1 15.2 9.4 8.1 8.9 12.1 13.1 10.7 13.6 11.9 13.6 15.6 9.2 12.3 11.7 8.3 9.5 9.2 11.0 9.9 10.4 10.8 12.0 11.7 12.9 15.8 11.8 10.4 13.4 11.6 10.8 11.2 9.7 9.9 12.9 12.2 9.4 9.1 11.0 9.8 13.3 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ × ○ ○ ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 化合物名※1 No * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * フルトラニルフルジオキソニルヘキサコナゾールプロチオホスプレチラクロールチフルザミド pp`-DDE ウニコナゾールＰミクロブタニルクレソキシムメチルフルシラゾール op`-DDD ディルドリンシプロコナゾールフェノキサニルエンドリンピリミノバックメチル(Z) クロルベンジレートフェンスルホチオン pp`-DDD op`-DDT メプロニルトリアゾホスエディフェンホスピリミノバックメチル(E) ピラフルフェンエチルレナシルプロピコナゾール pp`-DDT ジフルフェニカンテブコナゾールピリブチカルブビフェントリンエトキサゾールフェンプロパトリンビフェノックスホサロンシハロホップブチルメフェナセットシハロトリンアクリナトリンフェナリモルピラクロホス cis-ペルメトリン trans-ペルメトリンピリダベンカフェンストロールシフルトリンハルフェンプロックスボスカリドフルシトリネートシペルメトリンピリミジフェンフルミオキサジンフェンバレレートフルバリネートジフェノコナゾールデルタメトリン４まとめの適合判定の試験法として確立したい． GC-MS/MS による牛肉中の残留農薬一斉分析法を検討文献した．脱脂にアセトニトリル/n-ヘキサン分配を行い，精製にエチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニ 1）厚生労働省通知食安発第 0124001 号：食品に残留するカラムを用いることで短時間に多くの検体を処理するこ農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質とができ，全ての化合物で妨害ピークは見られなかった．の試験法，平成 17 年 1 月 24 日 117 化合物で一律基準濃度での妥当性評価を行った結 2）厚生労働省通知食安発第 1224 第 1 号：食品中に残留果，113 化合物について評価基準を満足したため，本分析する農薬等に関する妥当性評価ガイドラインの一部法は牛肉中の残留農薬分析法として有用であると考えら改正について，平成 22 年 12 月 24 日 3) 久保記久子，畑野和広：GC/MS/MS による農産物中のれた．残留農薬の一斉分析，福岡市保健環境研究所報，31，ガイドラインでは，添加回収試験を「基準値濃度」で行うこととなっている．また，一斉試験法の場合，基準値濃 88-94，2006 度の添加が困難であるため，「各農薬等の基準値に近い一 4）畑野和広，久保記久子：GC/MS/MS による農産物中の定の濃度」および「一律基準濃度」の 2 濃度による評価で残留農薬の一斉分析（Ⅱ），福岡市保健環境研究所報，も良いとされている．従って，基準値が 0.01ppm(一律基準 32，89-94，2007 を含む)以外の項目については，今後「各農薬等の基準値 5）農薬残留分析法研究班編：最新農薬の残留分析法【改に近い一定の濃度」での添加回収試験を実施し，食品規格 - 114 - 訂版】，423∼425，中央法規，2006