Title マウスにおけるアナフィラキシー・ショック発現におよぼす正常細菌叢の影響：無菌マウスと普通化したもと無菌マウスの比較 Author(s) 石原, 丈之; 岩井, 浤; 斎藤, 宗雄; 野村, 達次; 合田, 朗 Journal URL 東京女子医科大学雑誌, 55(1):23-26, 1985 http://hdl.handle.net/10470/10103 Twinkle:Tokyo Women's Medical University - Information & Knowledge Database. http://ir.twmu.ac.jp/dspace/ 2 3 〕号 (東女医大誌第鴻第1 頁 23-26 昭和6 0年 1月マウスにおけるアナフィラキシー・ショック発現におよぼす正常細菌叢の影響 -無菌マウスと普通化したもと無菌マウスの比較東京女子医科大学微生物学教室(主任:吉岡守正教授〉ハラシ之イシ付丈北里大学衛生学部微生物学教室石原実験動物中央研究所イワイ岩井ヒロシサイトウムネオノムラタツジ法・斎藤宗雄・野村達次町ムロ北里大学衛生学部微生物学教室ダ田朗 (受付昭和 5 9年 9月2 5日〉 InfluenceofNormalFloraonAnaphylacticShockinMice -ComparativeStudyi nGermfreeandNaturallyConventionalizedGermfreeMiceー TakeshiISHIHARA D e p a r t m e n to fM i c r o b i o l o g y( D i r e c t o r :P r o f .M o r i m a s aYOSHIOKA) T o k y oWomen' sM e d i c a lC o l l e g e i t a s a t oU n i v e r s i t y S c h o o lo fH y g e n i cS c i e n c e s，K HiroshiIW AI， MuneoSAITOandTatsujiNOMURA C e n t r a lI n s t i t u t ef o rE x p e r i m e n t a lA n i m a l s a n d AkiraGHODA S c h o o lo fH y g e n i cS c i e n c e s，K i t a s a t oU n i v e r s i t y The i n f l u e n c eo fp r e s i d i n gi n d i g e n o u sb a c t e r i ao nt h ei n d u c t i o no fi m m e d i a t et y p es y s t e m i c a n a p h y l a c t i cs h o c ki n d u c e d by o v a l u b m i nwas i n v e s t i g a t e du s i n gg e r m f r e e mice w i t h o u ti n d i g e n o u s b a c t e r i aandc o n v e n t i o n a l i z e dmiceo r i g i n a t e dfromg e r m f r e em i c e .Bothh i g h l ya n a p h y l a x i s s e n s i t i v eNC s t r a i n and l o w l ya n a p h y l a x i s s e n s i t i v e C3H s t r a i nm i c ec o n d u c t e d under t h ec o n v e n t i o n a lc o n d i t i o n showedt h es i m i l a rg r a d eo fs e n s i t i v i t yt ot h o s ec o n d u c t e du n d e rt h eg e r m f r e ec o n d i t i o n .Whent h e ywere h es e n s i t i v i t yi n c r e a s e di nNCmic eb u td e c r e a s e di nC3Hmice，t h a ti s，t h es e n s i t i v i t y c o n v e n t i o n a l i z e d，t a p p r o a c h e dt ot h eo r i g i n a lc o n v e n t i o n a ll e v e li nb o t hs t r a i n s .I n t e r m e d i a t e l ya n a p h y l a x i s s e n s i t i v eICR s t r a i nmiced i dn o tshowanys i g n i f i c a n ta l t e r a t i o n sa f t e rwhenc o n v e n t i o n a l i z e d . Theser e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ep r e s e n c eo fi n d i g e n o u sb a c t e r i ad e t e r m i n e st h es t r a i nd i 妊e r e n c e so f c o n v e n t i o n a lmicef o u n di ne x p e r i m e n t a la n a p h y l a c t i cs h o ck . 緒言ソレイターを用いた飼育技術の確立に伴ない容易今日，徴生物とその宿主における関連を検索するため，無菌動物を用いることは，ピニールアイとなった.無菌マウスにおいてもその飼育，栄養など，生物的特性川こついて，また，感染や免疫2ト 4) 2 3- 2 4 などについても，幾多の実験がまとめられている. x g e r m f r e eの Fl (繁殖した l代目〉マウスたE 免疫実験において，無菌マウスは， C o n v e n t i o n a l マウスと同様の生体の防御機能を有しているが， ( C o n v e n t i o n a l i z e dg e r m f r e e ;C v ' d G むを比較のため，対照群として用いた.この G v ' d G fマウス徴生物の抗原刺激を受けていないため，その免疫は，アナフィラキシ一実験中の飼育条件を無菌マ能は，未発達の状態であることが認められている. ウスと同じにするため一方，マウスのアナフィラキシー・ショックに 4週齢からビニールアイソレーター内で飼育し，実験に供した. 作方法やマウスの系統を選べば，マウスも，アナ 3 ) 実験に用いたマウスの飼育は，温度;2 2士 1' C，湿度;50-70%の恒温・恒湿の飼育室で行フィラキシー・ショックを発現する動物であるこなった.また，ビニールアイソレーター内の温度 inkらへ緒方・鈴田らめの報告以来，感ついて， F とが明らかになり，また，高橋ら 7)，谷岡ら的は， c高く，湿度はほとんど差は，飼育室より 2- 3' 同じ抗原である卵白アルブミンの単独感作によるがなかった.実験中および飼育中の固型飼料と飲アナフィラキシー・ショックの発現に，系統差が料水(水道水〉は， 1 2 3 ' C， 3 0分間，オートクレーあることを報告している. ブ滅菌をした. 2 . アナフィラキシー・ショックの発現実験本実験では，われわれは生体の免疫反応における，負の反応であるアレルギーの一種のアナフィ 1)抗原は，卵白アルブミン (NBC社製; 2回ラキシーに，徴生物，とくに，腸内フローラがし、結晶物〉を用いた.感{乍および惹起に用いた抗原かなる影響を与えるかを知る目的で，実験を行マウスの感受性とどのように異なるかを検索する液は，卵白アルブミン 10mgに対して生理食塩水 1 mlの割合で溶解したのち， s e i t z型細菌櫨過器で吸引櫨過し誠菌した浦液を用いた.また 1回の投与抗原量は， s e m i m i c r o K j e l d a h l法によってために，無菌マウスおよび，通常の環境に出し普卵白アルブミンの窒素量を測定し，換算した.ア通化したマウスについて，卵白アルブミンによるルブミン 2mg相当の抗原液(糧液)0 . 2 7 m lを用いなった.すなわち，無菌マウスのアナフィラキ o n v e n t i o n a l シー・ショックに対する感受性が， C アナフィラキシー・ショックの死亡率を比較し，た.なお，この抗原液は，チオグリコレート培地通常細菌叢のアナフィラキシ一発現におよぼす影 (栄研〉による無菌検査で，菌は検出されなかった. 響を検索した. 2 ) ショックの発現実験は，マウスの 5週齢時と 6週齢時の 2回，上記の抗原の 1回投与量を，背実験方法 1.マウス部皮下に注射し，感作 7日後の 7週齢時に同様に実験には，通常の環境下においてアナフィラキ背部皮下に惹起注射をして実施した.観察は，惹シー・ショックの発現率の高い NC系統と，逆に，起注射後9 0分間行ない，死亡数から死亡率を求め発現率の低い C3H系統のマウス，また，中程度のた.また，実験に使用した無菌マウスについて，発現率を示す ICR系統のマウスを雄・雌ともに用実験終了後，チオグリコレート培地(栄研〉を用いたいて糞便中の細菌検査を行なったが，すべて陰性 Germfree;Gf)マウスは，実験動物 1)無菌 ( であった. 中央研究所 ( 実中研〕において，近交系の NC 実験結果 (F?+F4代〉および， C3H/He( F 3 6代〉を子宮切断術によって胎仔を取り出し， ICR系の無菌マウ 1.無菌マウスの卵白のアルブミンによるアナフィラキシー・ショック発現の症状ス，雌親に里子として無菌動物化し，ビニーノレアイソレーター内で維持しているものである.実験には無菌化後， 2- 3代目のマウスを用いた.ま無菌マウスにおける，惹起注射から死に至るまでのアナフィラキシー・ショックによる症状は，まず，沈うつ状態となり，その後，歩行そうろうた， ICR系は，実中研にて維持している無菌マウと伏臥，後肢脱力，そして呼吸困難を経て死に至スを用いた. v ' d G fマウる.この症状は， Gfマウスも，また C 2 ) 無菌マウスを通常環境下に移して普通化しスも同様で、，差はみられなかった. - 24- 2 5 Table 1 Thes u s c e p t i b i l i t yt oa n a p h y l a c t i cshocki ngerm-freeandc o n v e n t i o n a l i z e dgermf r e emice Female Male S t r a i n No_ examined No.of d e a t h M o r t a l i t y r a t e ( % ) M o r t a l i t y rate(%) No. examined No.of d e a t h 107]M2) 5 6 . 3 3 3 3 1 2 3 2 9 697]叫 } 9 3 . 5 NC Germfree C v ' d G f ) ' 2 8 3 2 3 1 8 C3H Germfree 1 l C v ' d G f 1 6 4 6 3 7 1 8 . 8 1 5 . 2 1 7 2 9 1 0 6 588]同 ) 2 0 . 7 ICR Germfree 1 l d G f CV， 2 2 2 7 1 2 1 0 5 4 . 5 3 7 . 0 2 4 2 5 9 1 6 3 7 . 5 6 4 . 0 )C v ' d G f Note1 2 ) 3 ) ・ C o n v e n t i o n a l i z e dg e r m f r e e x ' t e s t p<0.01 x ' t e s t 0 . 0 1く p<0.05 2 . 無菌マウスと Cv'd-Gfマウスのショック発現率の比較 NC系， C3H系および ICR系の Gfマウスと C v ' d . G fマウスの!Js 白アノレブミンによるアナフィラキシー・ショックの死亡率を性別で T a b l e1 に示す. NC系の雄マウスでは，ショック死亡率が， Gfマウスで 10.7%，C v ' d . G fマウスでは 56.3%となり， Gfマウスの方が低く，ピー検定の結果，両群の死亡率の間には， 1%の危険率で有意差が認められた.また， NC系雌マウスの死亡率は， Gfマ v ' d . G fマウスは93.5%と，やはウスでは 69.7%，C り， Gfマウスの方が低く， 5 %の危険率で有意差りも高い死亡率を示し，有意差が認められた. C3 H 系においても， Gfマウスでは有意に雌の方が高かった.また， ICR系の C v ' d・Gfマウスでは雌の方が， Gfマウスでは雄の方が若干，高い死亡率を示したが有意差は得られなかった. 考察無菌マウスにおける生体防御機能としての免疫能は未発達な状態ながら十分に免疫応答ができる能力を有するということは，多くの研究者によって認められている.われわれは，無菌マウスと， C v ' d . G fマウスのアナフィラキシー・ショッグ死，C3Hおよび ICRの 3つの系統マウ亡率を， NC スを用いて検索したが，無菌マウスの場合では，が認められた一方， C3H系のショック死亡率をみると，雄マ NCと C3Hの 2系統の聞に雄・雌ともに大きな系ウスでは， Gfマウスが 18.8%，C v ' d . G fマウスは統差は認められなかった.しかし，無菌マウスを 15.2%で，有意差は認められなかった.しかし， v ' d . G fマウ雌マウスでは， Gfマウスが58.8%，C スは 20.7%と， Gfマウスの方が有意に高い死亡率普通化したとき， NC系マウスの方が C3H系マウを示した. た， ICR系のマウスは普通化による無菌マウスとまた， ICR系マウスでは，ショック死亡率が，スよりも雄・雌ともにアナフィラキシー・ショックの死亡率が高く，より系統差が認められた.まの差は認められず，中程度の感受性を示した. v ' d . G fマウス雄において， Gfマウスは 54.5%，C このように 3系統の無菌マウスを普通化した時は37.0%となり，雌マウスでは， Gfマウスがのアナフィラキシー感受性についての系統差は， 37.5%，C v ' d . G fマウスは 64.0%となった .ICR系谷間ら 8)が通常状態で飼育している各種系統マウマウスのアナフィラキシー・ショックによる死亡スのアナフィラキシー感受性の系統差を示した成率は，雄・雌ともに有意差は認められなかったが，績と同様で， NC系統は高いショック発現率を， v ' d . G fマ雌マウスにおいては， Gfマウスの方が C ICR系統は中程度の発現率を示し，一方， C3H系ウスより低い死亡率を示す傾向があった. 統は低い発現率を示した.このことから，マウス死亡率を性別で比較した場合には， NC系のマ v ' d G fともに雌の方が雄よウスで、は， Gfおよび C のアナフィラキシー・ショック発現率は，元来，系統差があまり見られないが，腸内菌叢の存在に - 25- 2 6 よって， N C系マウスの感受性がより高くなり，逆ウスと同程度の高い感受性を示した. に C3H系マウスの感受性は低下したものと考え 3 ) C3H系統マウスでは，逆に，普通化することられる.すなわち，遺伝因子としては系統差が大によって，雌で、無菌マウスより低い死亡率となり，きくないのに，腸内細菌叢によってショックの発また雄マウスでも同じ傾向を示し，通常環境下で現が促進されたり，抑制されることが示唆される. 飼育しているマウスと同程度の低い感受性であっこの現象がどんな菌叢によって起こるのか，また，た腸内菌叢の刺激に対するマウス系統間の感受性による差なのかは，今後の研究を待たねばならない. 一方，マウスのアナフィラキシー・ショックの病像について，鈴田 9)は，冠状動脈壁の平滑筋の収 4 ) 通常環境下において中程度の感受性を示す ICR系のマウスは，雄で Gfマウスの方が，また雌では Cv'd-Gfマウスの方が高い死亡率を示す傾向であったが，大きな差は認められなかった. 縮によっておこる心機能不全で、あると述べてい 5 ) 以上のように，腸内細菌叢の存在は，マウスる.われわれの未発表の実験において，無菌マウにおけるショッグ発現の系統差に関与することがスおよび Cv'd-Gfマウスのショッグによる死亡例示された. 6 ) また， N C系マウスと C3H系マウスでは，でも同様の病理像が観察された.すなわち，右心房の拡張，全身性の強い循環障害と浮腫性病変，ショックによる死亡率に性差が認められ，雄よりとくに，肝のうっ血が顕著に認められた.また，雌の方が高い値を示した. N C系マウスと ICR系マウスで死亡マウスの牌謝辞・稿を終るにあたり，御助言ならびに御校聞をに好酸球の浸潤，骨髄に好酸球増生が観察された賜わりました.吉岡守正教授に深謝いたします. が， C3H系マウスでは認められなかった.この，好酸球の局所への集合や，骨髄での増殖は，アレ文献ルギー・アナフィラキシーの反応では，その関連 1)篠田元扶・前島一淑:無菌動物の生理的特異性. 実験動物 2 7 ( 3 )3 1 5 3 2 7，1 9 7 8 ) 2 ) 前島一淑:無菌状態における腸内細菌と免疫.医学のあゆみ 9 4 ( 9 )4 8 4 4 8 9( 19 7 5 ) 3 ) 畔柳武雄・大高裕一・松橋編集:新免疫学叢書 2 . 免疫応答. 1 4 5 1 6 6医学書院東京(1 9 7 9 ) 4 )野本亀久雄:常在菌叢と生体防御機構.綜合臨床 3 0 ( 8 )2 0 4 1 2 0 4 5( 19 81 ) 5 )F ink，M.A.，e tal . : V a r i a t i o n si ns e n s i t i v i t y t oa n a p h y l a x i sandt oh i s t a m i n ei n b r e ds t r a i n s 5 ( 2 ) o fm i c e . Proc Soc Exp B i o l & Med 8 19 5 4 ) 3 3 6-3 3 8( 6 ) 緒方富雄・鈴田達男・ほか・各種近交系ハッカネズミの血清学的ショックに対する感受性の差.医学と生物学 4 9 ( 6 )2 4 8 2 5 2( 19 5 8 ) 7 ) 高橋弘・石原丈之・ほか:ICR-]CLマウスの A n a p h y l a c t i cs h o c kについて.実験動物 1 5 19 6 6 ) 1 2 8 (抄録) ( 8 )谷間功邦・江崎孝三郎:マウスの A n a p h y l a c t i c 7( 1 ) shockによる死亡率の系統差.実験動物 1 1 5( 19 6 8 ) 9 ) 鈴田達男:ハツカネズミのアナブイラキシーの機序に関する病態生理学的研究.東京医学雑誌 6 7 ( 6 B )1 4 6 3 1 4 8 5( 1 9 5 9 ) 0( 1 ) 1 0 )石川噂・アレノレギーと好酸球.代謝 2 3 3 3 9( 1 9 8 3 ) について詳しく研究されている川ことであり，このことから，腸内細菌叢が存在することによって， N C系マウスは感受性が高くなり， C3H系マウスは感受性が低下するということに関連していると考えられるが，このことについては，今後の実験を待ちたい. 結量五回目マウスにおける.アナフィラキシー・ショックに対する常在細菌叢の影響を調べるため，近交系の N Cと C3H/Heの 2系統，および ICR系統について， Germfreeマウスと Conventionalized germfreeマウスの雄・雌を用いて，卵白アルブミンによるアナフィラキシー・ショックの死亡率を比較し，つぎの結果を得た. 1)無菌マウスにおいても，アナフィラキシー・ショックを起こすことがわかった.しかし，マウスの系統による差は大きくはなかった. 2 ) N C系統マウスは，無菌マウスを普通化した時，ショックによる死亡率が雄・雌ともに無菌マウスより高くなり，通常環境下で飼育しているマ - 26-