浦上 財 団研究 報 告書VoL13(2005) 40 〈 平成15年 度〉 カボチ ャに見 い 出 された ア ンジオ テ ンシ ン変 換酵 素 阻害 物質 による生 体 機能試 験一 生活 習慣 病 の予 防効果一 早 狩 誠 ・ 佐 藤 公 彦 (弘前大学医学部) 1.は 2.カ じ め に ボチ ャに含 まれ るACE阻 害物質 の構造 解 析 西暦2015年 にお ける我が 国で は,65歳 以上の 人 口 は全 人 口の25%を 占 める こ とが予 想 さ れて い 2.1カ る。 この ように急速 な高齢 化が進 んで いる我が 国 カ ボチ ャか らACE阻 害 物 質の 精製 は以 下 の方 では,高 血圧 症,糖 尿病,認 知症 な どの生活習慣 法で行 った。 カボチ ャ細片 に9倍 量 の蒸留水 を加 病の 克服が大 きな研 究課題 となってい る。 え,ミ キサー な らび にポ リ トロ ンホモジナ イザー 今 回,研 究対象 と した ア ンジオテ ンシ ン変換酵 素(ACE)は,ア ン ジオテ ンシ ン1(Angl)か ボチ ャに含 まれ るACE阻 害物質 の精製 で微細粒 化 した。次 に遠心 して得た上 清 を陰イ オ ン交換樹 脂 カラムに付 した。 同 カラムに吸着 した ら強 力な血 圧上昇作 用 を有す るAngIIへ の産生 を 阻 害物 質 を希 塩 酸 に て溶 出 した 分 画 を濃 縮 後 行 うと同時 に,降 圧 ペプ チ ド,ブ ラ ジキニ ンの分 SephadexG-15ク 解 を行い,血 圧調節 機構 におい て重要 な役割 を演 た。次 に分子量1355を 示す シア ノコバラ ミン(ビ ロマ トグ ラフ法 にて順 次分 離 し じて い る酵 素で あ るP。 本酵 素の 阻害剤 は,高 血 タ ミンB1,)よ り遅い 分画 に溶 出 され たACE阻 害活 圧症 の治療 薬 としてすで に臨床 面で広 く応用 され 性 を示 す分画(図1)を てい るが,本 剤 はイ ンシュ リン抵 抗性 の改善 や心 た(収 量33mg)。 得 られた試料 を0.1%TFA溶 肥大 を抑制 する など肥満 に よって発症す る多 くの 再溶 解 しODSカ ラ ムに付 し,ACE阻 疾患 に も奏 功す るこ とが 知 られ てい る21。 め られた未吸着 画分 を濃縮後 凍結乾燥 した(収 量 従 っ てACE阻 害物 質 を多 く含 む食材 は 生活 習 集 め,濃 縮 後凍結 乾燥 し 液に 害活 性 の認 13mg) 慣病 の 予 防効 果が 期待 され る こ とか ら,我 々は ACE活 性 阻害物質 を含む食 品(原 料 も含 む)の 検 索 を行っ た。その結 果,カ ボチ ャに強 いACE阻 害 活性 を見 い出 した。本研 究で はカボチ ャに含 まれ るACE阻 害 物質の 同定 を行 うと ともに,血 圧 降下 作用,脂 肪 蓄積抑 制お よび記憶 保持増 強につ いて 解析 を行 い,カ ボチ ャの 肥満,高 血圧症,痴 呆 症 な どの生活 習慣病 に対す る予 防食品 としての可 能 性 につい て検討 した。 図lSephadexG-15カ の分 離. ラム クロ マ トグ ラ フ 法 に よ る_aCE阻 害物質 カ ボチ ャに 見い 出 され たア ン ジオ テ ンシ ン変換 酵 素f4111 物質 に よる生 体 機能 試験 生活 習慣 病 の 予防 効果一 なお,ACE活 41 性 阻害 の測定 は,ラ ッ ト肺 よ り均 一 した酵素標 本31を 用い我 々が 開発 した方 法lIに て行 った。 2.2イ オ ン交換 カラム高 速液体 クロマ トグ ラ フ法に よる分離 精製 上記試 料 につい て陰 イオ ン交換樹 脂充填 カ ラム (TSK-GELSAX,TOSOH)を 用いたHPLC法 に て分離精 製 を試み たと ころ,阻 害活 性を示 す3つ のピー クが得 られ(図2),そ れぞ れを分取 後濃縮 図2HPLC法 によるACE阻 害物質の精製 乾 燥 し機 器分析 に供 した(Peak1,約1mg)。 2.3質 量 分析 な らびに核磁 気共 鳴ス ペ ク トル 分析 ボチ ャそ の もの による血圧 降下作 用につ いて 自然 発症 高血圧 ラ ッ ト(SHR,体 重約3008,日 本 クレ 上記試 料の 中で収量 の もっ とも多 かったPeakl アジャパ ン)を 用 いて検討 した。 なお,投 与飼料 につ いて 質量 数 な らび に核 磁気 共鳴 スペ ク トル の調 整は以 下の ように行 った。 まず カボチ ャ砕片 (NMR)の 測 定 を行 い,ACE阻 害物 質の構造 解析 を行っ た(図3,4)。 を蒸 留水 とと もに ミキサ ーにて粉砕 しラッ ト用粉 餌 を混 合 した。 カ ボチ ャの 含有 量 はラ ッ ト粉餌 質量分析 で はマ トリ ックス としてグ リセ リ ンを 25g(1日 の平均摂 取量)に カボチ ャ7,5または15g 用 いFABのpositiveお よ びnegativeモ ー ドに て測 を含 む ように調整 し,適 当な大 きさに裁断 した も 定 を行 った。そ の結果 複数 のピー クが認め られた の を乾燥 させ 飼料 と して用 いた。 が,NMR測 定結果 か らACE阻 害物 質は 質量数569 そ の結果,カ ボ チャ水抽 出液混合 飼料投 与群で を示す もの と推 定 した。なお,現 在 まで明 らか と は コン トロール群 に比べ,収 縮期 および拡 張期血 なってい る部分構 造 を図5に 示 した。 圧い ずれ も開始3日 後 より低 下 し投 与期 間終 了 ま 3.カ ボ チャに よ る生体 機能調 節の検 討 で血圧 降下 は持続 した(図6)。 3.2体 3。1血 圧 降下作 用につ いて カボ チ ャ中ACE阻 重増 加 なら びに脂肪 蓄積 抑制 効果 につ いて 害物 質 の合成 品 に よる血 圧 降 下作用 を検討す る ことがで きなか ったた め,カ 図3阻 カボチ ャその ものを含 む飼 料(カ ボチ ャ含 有量 20,50%)を 害物質(Peakl)のFABMassに 用 いた以 前の検 討で は,ラ ッ ト(SD. よる分析 42 浦上 財 団研 究報 告 書VoL13(2005) 図6カ 図4阻 害物 質(Peakl)のNNIRに ボチャ投 与によるSHRの1血圧降 ド よる分析 図7カ ボチ ャ抽出液投与による体 重増加抑制 活 性 を測定 し,ラ ッ ト粉餌25g(1日 量)にACE阻 の 平均 摂取 害物 質1ま た は3units(1munitは ACE活 性50%阻 害量)を 含 むよ うに蒸留水 と とも に混合 し,適 当な大 きさ に裁 断 したもの を乾燥 さ 図5 阻害物質(Peak1)の 部分構造 せ,前 項 と同様 に飼料 を調整 した。 そ の結 果,ACE阻 害 物質混 合飼料投 与群 では コ 日本 ク レアジ ャパ ン)の 体 重増加 抑制効 果が認 め ン トロール群 に比べ,ACE阻 られなか った(デー タ未掲載)。 これは カボチ ャに して体 重増加 の抑制 が認め られた(図7)。 含 まれ る大 量 の糖 成分 に よ りACE阻 害 物 質の 体 投与期 間終了 後に採取 した腹 腔内 な らび に副睾丸 重増 加抑制 効果 を相殺 した ものと考 えられた。 従 脂肪 組織 重量 も体重 と同様ACE阻 害 物 質の 濃 度 って今 回 の検 討で は カボチ ャ水 抽 出液 よ りACE に依存 した増 加抑制 が認 められた(表1)。 阻害物質 を陰 イオ ン交換 樹脂 にて部分精 製 し糖 含 有量 を低下 させ た(水 抽 出液 の90%以 下)抽 出液 を用 いた。 飼料 の 調整 は その抽 出液 のACE阻 害 害物 質の濃度 に依存 また, カボチャに見い出されたアンジオテンシン変換酵素阻害 物質による生体機能試験一生活習慣病の}防 効果一 表1カ ボチャ抽出液投与ラッ トでの脂肪組織重量の変化 43 れCお よ びN末 端 ペ プチ ドを合 成 した 後,Key HoleLimpetHemocyaninと の結 合体 を抗 原 と し てウサ ギに免疫 して作 製 した。 またACE抗 体 は, ラ ッ ト肺 より精 製 した もの を抗 原 としてウサ ギに 免疫 して作製 した。 そ の 結 果,ラ 3.3カ ボ チャACE阻 害 物質 によ る長 期記憶 保 持 機 能増強効 果 につ いて ッ ト脂 肪 組織 に はAGT(52-56 kDa,図8A),ACE(170kDa,図8B)お 受容体(47kDa,図8C)の 前 項 と同 様 の飼 料 を用 いACE阻 害物 質 に よる よびATl 発現が 認め られたが, 腹腔 内脂 肪組 織 で はAGTの み が高発 現 し,発 現 重250g,日 本 クレアジ ャパ ン)で して いるAGTは 複 数のバ ン ドとして観察 された。 の長 期記憶 保持機 能増 強効果 を5日 間測 定 した。 これ らの バ ン ドはN一グ リコシ ド結合 を特 異 的に な お,記 憶 保持 の解析 はモー リス水迷路 法 にて行 切断す る酵素(グ リコペ プチダーゼF)処 い標 的へ の到達 時間で 評価 した。 なお,飼 料 の調 り消失 し一つ のバ ン ドとして検出 された ことか ら ラッ ト(SD,体 整 は項 目3.1と同様 な方法 で調 整 した。 その時 の (図8A),複 数のAGTの 理によ バ ン ドはグル コ シ レー カボチ ャの 含有量 は それぞ れ5お よび15g相 当 と ションの個数 の差61に よることが示 唆 され た。一 した。 方,皮 下 脂肪 組織 で はAGTは 主 に2本 のバ ン ド その結 果,ACE阻 投 与群 に比 べ,ACE阻 害 物質混 合飼料投 与群で は非 害物質 の濃度 に依存 して長 期 記憶保持 の増 強効果 が認 められ た。 4.ラ ッ ト脂 肪 組織 で のAGT,ACEお が検 出され,こ れ ら も同酵 素処理 によ り一 つのバ ン ドに変換 された(図8A)。 よびAT1 受容 体の発 現 数の 差が少 ない ことが示唆 された。 5.考 ラ ッ ト脂 肪組 織 でのAGT,ACEお よびア ン ジ オテ ンシ ンH受 容体 一タ イプ1(AT1受 従っ て皮下脂肪 組織 に発 現 して い るAGTで は グル コ シレー シ ョ ンの 察 ア ンジ オテ ンシン変換酵 素(ACE)の 阻害物 質 容 体)の には血圧降 下作用 が期待 される ことか ら,天 然物 発 現変化 をWestern-blot法51で 検討 した。 なお, 等か ら多 くのACE阻 害物 質が見い 出され,こ れ ら AGTお の ほ とん どは特許 申請が なされて いる。我 々の研 よびAT1受 容体 に対 す る抗 体 は,そ れぞ A Anti-AGTAb 図8ラ B Anti,ACEAb CAnti,ATIAb ット脂肪組織 での レニ ンーアンジオテンシン系因子の発現 44 浦 上 財団 研究 報 告書Vol.13(2005) 究 にお い て 見 い 出 さ れ た カボ チ ャ に 含 まれ る 積 の抑制が 認め られた が,そ の機構 は生体 内Ang ACE阻 害 物 質 につ いて は未 だ特 許 申請や 国 内外 IIの産生抑 制に よる前駆 脂肪細 胞の分 化誘導 およ での報告 も認 められ てお らず 今回得 られた我 々の び脂 肪合成 の抑制 に よるもの と推 定 される。 更に 結 果の みであ る。 また特 許 申請 され た中で乳 蛋 白 AngHは やイ ワシ蛋 白の蛋白 分解酵素 処理 によ り見 い出 さ らACE阻 害物 質投 与 に よ り筋 肉等 で の イ ンス リ インス リン抵抗性 を促進 させ る2こ とか れたACE阻 害物 質は,近 年血 圧降下作 用 を目的 と ン感受性が 充進 し,脂 肪組 織へ の糖の取 込み の減 する保健飲 料剤 と して市販 されてい る。 しか しな 少が 脂肪組 織重量 の増加抑 制 をもた らした可 能性 が ら,ACEの 特 異的 阻害剤 カプ トプリル はラ ッ ト も考 え られ るが,こ れ らの点 について は今後詳 細 におい て脂肪蓄 積の抑 制や記 憶保持 の増強 などの な検 討が必 要で あろ う。 本研究 では,ラ ッ トの皮 生理作用 も示す こ とか ら,ACEが 下 お よび腹 腔 内脂 肪組織 でAGTの 血圧 調節 ばか り ではな く,脂 肪 蓄積や 記憶保 持の機構 に も深 く関 発現 量 が異 な る こ とや発 現 して い るAGTの グ リ コシ レー シ ョ わって いる ことを示 し,従 ってACE阻 害物 質に は ンのパ ター ンが異 なる ことを見 い出 し,こ の結 果 高血圧,肥 満形 成そ して認知 症の予 防効果が 期待 は培 養 細胞 に ヒ トAGT遺 伝子 導入 を 行っ た際 に される。 発現 す るAGTの 今 回カ ボチ ャ に含 まれ るACE阻 害 物質 の最 終 パ ター ンと同様 の 結果hIを 示 し た。 更 に活 性型Angllを 産生 す る酵 素ACEお 的な構造 決定 までは至 らず,そ の合 成品 を用 いた びAngHの 各種生体 機能試験 を行 うこ とがで きなかっ たが, で高 い ことが明 らか となった(図7,図8A,B)。 よ 作 用 す るATI受 容 体 の発 現 量 は皮 下 カボチ ャその もの,ま たは カボチ ャか ら抽 出 した これらの結 果は皮 下お よび腹腔 内脂肪組 織の生 理 ACE阻 害 物 質 を含 む画 分 を用い た各 種生 体機 能 的役 割が異 なる ことを示唆 して いる。一 般 にヒ ト 試験 に おいて,カ ボチ ャに は血圧降下 作用,脂 肪 にお いて は内臓脂肪 組織が 各種生 活習慣 病の リス 蓄積抑制 お よび記憶保持 増強 効果 を示 す成分 が含 クファ クター として考 えられて いるが,皮 下お よ まれて いる ことが認 められ た。これ らの効果 は, び腹 腔内脂 肪組織 での レニ ンー ア ンジオテ ンシン 合 成阻害物 質 による検討 が必 要であ るが,カ ボチ 系各 因子の 発現量 の違い を含め た両脂肪組 織 の生 ャに含 まれ るACE阻 害物 質 に起 因す る こ とが 予 理的 役割 について は今後 の詳細 な検討が 必要 と思 想 される。ACE阻 わ れる。そ の結果 か らこれ ら脂肪組 織 と生活習慣 害物 質 に よる血 圧 降下 の作 用 機 序につ いて はすで に明 らか となっ ているが,脂 肪 蓄積の抑 制お よび記憶 保持 の増強 の機序 につい 病 との関連 が明 らかに されよ う。 一方 ,ACE阻 害剤 に よるラ ッ トやマ ウスでの記 ては十分 な解析 は行 われてい ない。 憶保持 増強11瀞 や 高血圧患 者での ノ ンコンプ ライ 1987年 ラ ッ ト褐色 脂肪 組 織で のAGTの 発現 が ア ンス(薬 の飲 み忘 れ)の 改 善'31が知 られて いた 確 認 されて以 来71,脂 肪組織 での レニ ンー ア ンギ が,そ の機 序につ いては解 明 され てい ない。 しか オテ ンシ ン系 の存在 が明 らか とな りつ つあ るn。 しなが ら,近 年 記憶 保持 に深 く関 わる と され る AGTか AnglV受 容体(AT4)の らレニ ンお よびACEに 性 型AngHは よ り産 生 され た活 プ ロス タサ イ クリンを産生 し前駆 脂 内 在性 リガ ン ドと して LVV一 ヘ モ ル フ ィ ンー7(LVVYPWTQRY,LVV- 肪細 胞の分 化 を促 進す る91こ とや分化 した脂肪 細 H7)が 単離 され だ1〕 。我 々はラ ッ ト脳 よ り均一 に 胞 での脂肪 の蓄積 を促進 させ るPこ とが知 られて 精製 したACEが,内 いる。従 って カボチ ャ水 抽出液投 与 によ り脂肪 蓄 以上 の速 度でLVV-H7を 在性基 質で あるAngIの60倍 分解 す るi51ことや カ ブ ト カ ボチ ャ に見 い出 され た ア ンジオ テ ン シン変換 酵 素 阻害 物 質に よ る生体 機 能試験 一 生 活習 慣病 の 予防 効 果一 プ リル(20,50mg/kg)を3週 で の脳 内LVV-H7濃 間投与 した ラッ ト 度 は非 投与 群 に比 べ それぞ れ 約1.6および2.0倍高 い値 を示す(未 発表)こ とか ら, こ の物 質が 脳 内ACEの 内 在性 基 質で ある可 能性 お よび 脳ACEが 記 憶 保持 機構 に も関与 してい る 可能性 を推 定 している。 従っ てカボチ ャ抽出液 に よる記 憶保 持 増強 効果 はACE活 性 抑制 に よ る脳 内LVV-H7濃 度上昇 に基づ くもの と思 われ る。 今 回の検 討 において,ACE阻 害物質 を含む カボ チ ャその もの は血 圧降下 作用,脂 肪蓄積 の抑制 お hydrolysisbythesomaticandtesticularisozymeofhuman angiotensin-convertingenzyme.Biochim.Biophys.Acta 1997:1139:31-8. 4>HaaakariM.SeitoR.FurugoriA.HashimotoY, MurakamiS.Animprovedcolorimetricassayof angiotensin-convertingenzymeinserum.Clin.Chim.Acta l984;144:71-5. 5)TowbinH。StaehelinT,GordonJ.Electrophoretic transferofproteinsfrompolyacrylamidegelsto nitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications. Proc¥atlcadSciL'SA.1979:76:430-4. 6)Gimenez-RoqueploAP.CelerierJ.LucarelliG,CorvolP, JeunemaitreX.Roleof¥-glycosylationinhuman よび記憶保 持増 強効果 を示す ことが明 らか となっ た。 この結 果か らカボ チャそ のもの,ま た はカボ チ ャ に含 まれ るACE阻 害 物質 に は生 活習慣 病 の 予 防効果が 期待 され,現 在本物 質の構造 決定 な ら angiotensinogen.JBiolChem.1998:273:21232-8. 7)CampbellDJ,HabenerJF.Cellularlocalizationof angiotensinogengeneexpressioninbrownadiposetissue andmesentery:quantificationofmessengerribonucleic acidabundanceusinghybridizationinsitu.Endocrinology. び に合成法 の確立 を行 ってい る。 1987;121:1616-26. 8)EngeliS.NegrelR,SharmaAM.Physiologyand 最 後 に本 研究 を実施す る にあた り,研 究助 成金 pathophysiologyoftheadiposetissuerenin-angiotensin system.Hypertension.2000:35:1270-7. を賜 りました浦上 食品 ・食文化 振興財 団な らびに 関係 各位 の皆様 に心か らお礼 を申 し上 げ ます 。ま た,本 研 究 にお いてNMR測 定 を して い ただ いた 東北 大学薬 学部 の伏谷真 二助教 授,な らび に構 造 9)NegrelR,AilhaudG.Metabolismofarachidonicacid andprostaglandinsynthesisinthepreadipocyteclonalline ob1771.BiochemBiophysResCommun.1981;98:768-77. 10)JonesBH,StandridgeMK.MoustaidN.AngiotensinII increaseslipogenesisin3T3-LIandhumanadiposecells. 解析 を行 って いただい てい る弘 前大学 農学生 命科 学 の奥野智 旦教授 お よび橋本勝 助教授 に深 く感謝 い た します 。 Endocrinology.1997:138:1512-9. 11)HirawaN,UeharaY.KawabataY,NumabeA.GomiT, IkedaT,SuzukiT,GotoA,Toyo-okaT.OmataM.Longterminhibitionofrenin-angiotensinsystemsustains memoryfunctioninagedDahlrats.Hypertension.1999:34: 文 献 1)ErdosEG.AngiotensinIconvertingenzymeandthe 496-502. 12)VlondadoriC.HengererB,DucretT,BorkowskiJ. changesinourconceptsthroughtherears.Hypertension Delayedemergenceofeffectsofmemory-enhancingdrugs: 1990:363-70. implicationsforthedynamicsoflong-termmemory.Proc 2)HansonL,LindholmLH,NiskanenL,LankeJ.Hedner T,NiklasonA,LuomanmakiK.DahlofB,deFaireLi, NatlAcadSciL"SA.1994:91:?041-5. 13)YodfatY.Bar-OnD.AmirM,CristalN.Qualityoflife MorlinC.KarlbergBE.WesterPO.BjorckJE.Effectof innormotensivescomparedtohypertensivementreated angiotensin-convertingenzymeinhibitioncomparedwith withisradipineormethyldopaasmonotherapyorin conventionaltherapyoncardiovascularmorbidityand combinationwithcaptopril:theLOMIR-MCT-ILstudy.J mortalityinhypertension:theCaptoprilPreventionProject (CAPPP)randomizedtrial.Lancet1999;353:611-6. 3)HayakariM,SatohK.OokawaK,KanoH.MurakamiS. IkedaN,TsuchidaS.KineticevaluationofQ-neoendorphin HumHypertens.1996:10:117-22. 14)MoellerI.LewRA,MendelsohnFA,SmithAI,Brennan ME.TetazTJ.ChaiSY.TheglobinfragmentLVVhemorphin-7isanendogenousligandfortheAT4receptor 45 46 浦上 財 団研 究報 告書Vol.13(2005) inthebrain.JNeurochem.1997;68:2530-7. 15)HayakariM,SatohK,IzumiH,KudohT,AsanoJ, YamazakiT,TsuchidaS.Kinetic-controlledhydrolysisof Leu-Val-Val-hemorphin-7catalyzedbyangiotensinconvertingenzymefromratbrain.Peptides.?003:24:107582. Studyofantihypertensiveandanti-lipogeneticeffect.andmemoryenhancementbypumpkincontainingangiotensin-convertingenzymeinhibitors 47 Studyofantihypertensiveandanti-lipogeneticeffect,andmemoryenhancementbypumpkincontainingangiotensin-convertingenzymeinhibitors MakotoHayakariandKimihikoSatoh (SecondDepartmentofBiochemistry,SchoolofMedicine,HirosakiUniversity) Wefoundthenovelinhibitorsofangiotensin-convertingenzymefrompumpkin,and analyzedthestructureoftheinhibitor.Themolecularweightofmajoroneofthreewas determinedtoMr=569bytheanalysesoffastatombombardmentmassspectrometryand nuclearmagneticresonance,andthiscompoundcontainedmanyhydrocarbon,some carboxylicacidsandtrhreeorfivenitrogens.Furthermore,westudiedanti-hypertensive,antilipogeneticeffectsandmemoryenhancementbypumpkinorpumpkinextractswhich containedtheACEinhibitors. ThebloodpressuresofSHRdecreasedabout10%ofcontrolbypumpkincontainingdiets (7.5and15g)withdose-dependentmanner.Byusingpumpkinextract,whichcontainedlow concentrationofsugar,theincreasingweightofratintraperitonealandepididymisadipose tissuesweredepressed,andthememoryretrievalsofratwereimprovedwithdosedependentmanner.
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