28/11/2014 TD Immuno S5 2014-2015 Pr : Nadia . Dakka 1 28/11/2014 • Anticorps monoclonaux Population homogène d ’anticorps issus d ’un « seul et unique » clone de cellules B Les anticorps monoclonaux sont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné . Ils sont par définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte. • Avantage Spécificité Affinité Production massive et constante 2 28/11/2014 3 28/11/2014 4 28/11/2014 Les Ac monoclonaux sont disponibles indéfiniment une fois les hybridomes immortalisés. La production des Ac monoclonaux nécessite moins d’animaux par rapport à la production des Ac polyclonaux, Les Ac polyclonaux peuvent être obtenus beaucoup plus rapidement, à moindre coût et avec moins de compétences techniques que pour produire des Ac monoclonaux. Les Ac polyclonaux sont obtenus en 4 à 8 semaines, tandis que la production d’Ac monoclonaux peut prendre 3 à 6 mois. 5 28/11/2014 Principe de la production des anticorps monoclonaux • Les partenaires de fusion – cellules B extraites d ’organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions), des plasmocytes sécrétant des Ac. – cellules myélomateuses de souris • Méthode de fusion – Chimique – Physique • Sélection, clonage in vitro d’un hybridome producteur d’Ac. • Expansion multiplication de clones de l’hybridome, soit in vitro, soit in vivo, afin d’obtenir de grandes quantités d’Ac. 6 28/11/2014 7 28/11/2014 • L'immunisation – Les sources d'antigènes degré de pureté : élimination des contaminants – L'immunisation de l'animal • dose et forme de l ’antigène • adjuvants • voie et nombre d ’injection 8 28/11/2014 Immunogène Antigène n Protéine protéine lyophilisée Haptène Quantité de l’immunogène par injection et par animal. 2 - 50 µg en solution 2 - 50 µg Incluse dans un gel de polyacrylamide 1 - 10 µg Peptide 1 - 10 µg Nucléotide glucide Substance chimique naturelle ou synthétique 9 28/11/2014 Les animaux, souris ou rats, utilisés à la fois pour l’immunisation en vue de la préparation du clone d’hybridome et pour la production d’Ac monoclonaux (production in vivo), doivent être de même souche (syngéniques) pour des raisons d’histocompatibilité. 10 28/11/2014 César Milstein et Georges Köhler (1970) 11 28/11/2014 + IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC L’ANTIGÈNE ÉTUDIÉ OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES 12 28/11/2014 Les cellules de myélome utilisées dans les hybridomes n’ont pas l’enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine transférase) . Elles ont phosphoribosyl perdu la capacité de produire des immunoglobulines (mutants Ig-). Les cellules de myélome n’apportent que leur propriété d’immortalité aux cellules résultant de la fusion. 13 28/11/2014 L’autre partenaire de la fusion est une population de plasmocytes possédant l’enzyme: HGPRT et sécrétant les Ig. Ces plasmocytes contribuent à la capacité des hybridomes à survivre dans le milieu de culture sélectif HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine). 14 28/11/2014 On fusionne les plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi, avec des cellules de tumeur : myélomes (cellules immortelles) . La fusion membranaire se fait grâce à l'addition de polyéthylène glycol (PEG) et permet ainsi d'obtenir des hybridomes. Les hybridomes ont la capacité de se multiplier plus rapidement que les plasmocytes productrices d'anticorps et de développer indéfiniment des anticorps spécifiques. 15 28/11/2014 Méthodes de fusion • Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG) – fusion des membranes cytoplasmiques – rendement de fusion élevé – DMSO renforce la viabilité cellulaire • Fusion physique : Electrofusion – Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques – technique onéreuse – moins destructrice 16 28/11/2014 + Par méthode chimique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly éthylène glycol) SELECTION Par méthode physique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION 17 28/11/2014 Sélection, clonage • Sélection sur milieu sélectif HAT – – – – – – – Hypoxanthine Aminopterine Thymidine facteurs de croissance : IL6 β mercaptoethanol sérum de veau fœtal fibroblastes sous atmosphère CO2 seuls les hybridomes se développent 1 x 105 cellules/ml 18 28/11/2014 Après fusion des hybridomes, les cellules sont réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. le mélange de toutes ces cellules (hybrides et cellules parentales) est placé sur un milieu de culture sélectif : HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine) . Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT . 19 28/11/2014 La sélection par le milieu HAT dépend du fait que les cellules de mammifères peuvent synthétiser les nucléotides par deux voies différentes : La voie de novo et la voie de récupération en incorporant directement les purines et les pyrimidines dans les nucléotides nécessaires à la synthèse de l’ADN et de l’ ARN. Les enzymes qui catalysent la voie de récupération incluent HGPRT et TK. Une mutation de l’un ou l’autre de ces deux enzymes bloque la capacité de la cellule à utiliser la voie de récupération et entraîne sa mort dans le milieu HAT . 20 28/11/2014 + Culture sur milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine Cellule myélomateuse HGPRT- MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser HYBRIDOME SELECTIONNE Lymphocyte B MORT CELLULAIRE disparition après quelques divisions 21 28/11/2014 + Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré, les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule : Sur milieu gélosé Par dilution limite Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit 22 28/11/2014 • Sélection d ’une seule cellule et mise en culture. Clonage dans l’Agar, dans l’Agarose on visualise directement les colonies cellulaires dans l ’agar, que l ’on remet en culture après dilution. Clonage par dilution limite la plus utilisée dans les laboratoires. Réalisée directement dans une plaque de microtitration peu onéreuse Longue. 23 28/11/2014 • Immuno précipitation – Ouchterlony, Mancini • Radio immunologie (RIA) – radio isotope • Immuno enzymologie (EIA) – enzyme (ELISA) • Compteur de cellules (Cell sorter) • Western Blot 24 28/11/2014 + TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT • DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE ELISA • DU TYPE D’ANTICORPS PRODUIT PAR DES METHODES D’IMMUNOPRECIPITATION 25 28/11/2014 • 2 techniques ELISA – Compétition – Sandwich : la plus utilisée pour ce propos 26 28/11/2014 27 28/11/2014 ELISA sandwich Ac de capture 28 28/11/2014 • Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris. • On peut alors multiplier les clones positifs (producteurs de l’Ac d’intérêt) soit en continuant de les cultiver in vitro, soit en utilisant l’animal immunisé pour une production in vivo. 29 28/11/2014 30 28/11/2014 • Avantages – Concentration élevée en Ac Mo – Pas d’intermédiaire industriels • Inconvénients – Utilisation de l’animal – Présence de protéines murines – Contaminants – Stress de la souris 31 28/11/2014 + Amplification des hybridomes Production par cultures cellulaires OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX Production dans les liquides d'ascites CONSERVATION DES HYBRIDOMES 32 28/11/2014 • Injection des hybridomes dans le péritoine de souris • Développement d ’une tumeur : ascite • Prélèvement des anticorps par ponction de liquide d ’ascite • Rendement élevé 20 g/l • C’est la souris qui régule les conditions de culture ! • Purification du liquide d ’ascite nécessaire 33 28/11/2014 • • Préparation de l’échantillon Purification principale – Chromatographie d’affinité • Affinité immunologiques – spécifique du Fc. – spécifique de l’antigène. Ligand Impuretés Analyte 34 28/11/2014 Fixation Elution 35 28/11/2014 Elution par déplacement avec l’antigène libre Elution par déplacement avec un analogue 36 28/11/2014 • Avantages – Pas d’utilisation d ’animal – Production de grandes quantité d’anticorps – Pas de personnel d’animalerie – Pas de contaminant • Inconvénients – Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal – Contamination par les hybridomes morts – Ac de plus faible affinité – Plus chère pour de petites production 37 28/11/2014 • • • • Basé sur la technologie des fibres creuses. Diminution des coûts, du temps. Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté Pas ou peu de contaminant (6 x moins) 38 28/11/2014 • Spécificité – Reconnaissance d ’un seul motif épitopique – Réactions croisées, non-spécifiques. – Maintient de l ’activité après modification chimique • L'affinité – Élevée – Constante et contrôlée • Avantages de ce type de production – Constante – reproductible 39 28/11/2014 Tout anticorps est caractérisé par deux propriétés : - capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands - participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose …) 40 28/11/2014 41 28/11/2014 Premières applications thérapeutiques des Ac Mo en 1981 avec le muromonab utilisé dans le traitement des épisodes de rejet aigu en transplantation d'organes. Inconvénients des premiers anticorps monoclonaux produits par des hybridomes murins: - une demi-vie courte -immunogènes. Les progrès de la biologie moléculaire, au cours des années 1980, ont permis la production d'abord d'anticorps chimériques, puis d'anticorps humanisés et enfin d’anticorps totalement humains. Depuis, le développement et l'utilisation clinique de ces anticorps monoclonaux ont connu un essor spectaculaire. 42 28/11/2014 100% souris Ac monoclonal de souris Ac monoclonal chimérique 75% homme 25% souris 90 % homme 10% souris Ac monoclonal humanisé Ac monoclonal humain 43 28/11/2014 44 28/11/2014 La chimérisation et l'humanisation permettent de varier les isotypes des potentielles anticorps de donc l'anticorps de manipuler (par exemple, les la fonctions fixation du complément). Un autre avantage: augmentation de la demi-vie de l'anticorps, qui passe de moins de 20 heures avec les anticorps murins à plusieurs jours, s'approchant des 21 jours des IgG humaines endogènes. Ceci permet une meilleure utilisation de ces Ac comme agents thérapeutiques. 45 28/11/2014 ANTICORPS ENTIEREMENT HUMAINS: Des anticorps entièrement humains et biocompatibles sont cependant de plus en plus recherchés pour l'immunothérapie passive. Trois grands types de technologies ont été mis au point pour les obtenir: - Techniques d'hybridomes, - Phage display, - Souris transgénique. 46 28/11/2014 47 28/11/2014 Les anticorps monoclonaux utilisés comme médicaments ont tous une nomenclature se terminant par « mab », acronyme de « monoclonal antibody » comme par exemple le rituximab. Ils sont utilisés dans les tests de grossesse, dans de nombreux domaines de la recherche en biologie et par de nombreuses techniques (cytométrie en flux, western blots.), dans les tests d'immuno-hématologie. Les anticorps monoclonaux, en monothérapie ou en association avec une chimiothérapie, ont pris place aujourd’hui dans le traitement standard de nombreuses formes de cancers. 48 28/11/2014 Herceptin (Anticorps humanisé) 49 28/11/2014 Biotechnologie Recherche Diagnostic Thérapeutique Cytométrie en flux, Immunohistochimie Etude des lignées cellulaires Etude des marqueurs des cellules non lymphocytaire Etudes des cellules pathologiques Purification d’antigènes Recherche d’Ac ou d’Ag Immunodétection (ELISA, RIA) Imagerie (immunoscintigraphie) ≈ 20 Ac monoclonaux utilisées en thérapeutique + 70 Ac monoclonaux en essais cliniques traitement immunosuppresseur (Maladies auto-immunes et inflammatoires, rejet de greffe) traitement anticancéreux (élimination des cellules cancéreuses) cardiologie (traitement anti-thrombotique) infectiologie (prophylaxie antivirale) allergologie (traitement asthme) 50 28/11/2014 Beaucoup d’espoirs soulevés dans le traitement de nombreuses pathologies lourdes, pour lesquelles les thérapeutiques conventionnelles ont montré leurs limites. (thérapeutiques ciblées) Toutefois le coût de ces produits est un facteur limitant leur utilisation, d’autant plus que de nombreuses applications restent des traitements de longue durée. Enfin et en l'absence d'études de tolérance à long terme, le suivi et la prudence sont indispensables pour mieux évaluer les risques liés à leur utilisation. 51
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