1細胞の機能や構造を計測するためのマイクロチップ技術中央大学理工学部精密機械工学科教授鈴木宏明 1 開発① 1細胞に対する薬剤応答検出，遺伝子解析用マイクロチップ 2 背景集団中の個々の細胞は「ヘテロ」である細胞の多様性が，がん，免疫，発生・分化などにおいて重要 Burrell et al., The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancer evolution, Nature, 2013. 3 従来技術とその問題点 1細胞（シングルセル）解析 1) 細胞を個々に「分ける」 2) 試薬を加えて反応させ，その結果を「解析する」（場合によっては反応産物を取り出す）マイクロ流体技術が多く使われているドロップレットマイクロウェルマイクロ流体回路 Fluidigm社 C1 IFC Rettig & Folch, Anal. Chem., 2005 Klein et al., Cell, 2015. 大量の液滴を生成可能ポンプやチュービングの煩雑さ液滴生成の不安定性拡大 Tokimitsu et al., Cytometry A, 2007. 細胞と同程度の大きさの穴簡便に高密度封入可能 1細胞に対する溶液量が少ないナノリットルの微量流体を電子回路のように精密制御可能チップや制御系が複雑，高価 4 新技術の特徴シンプルなマイクロウェルを三次元形状に変更細胞サイズのウェルにより高封入率を確保しつつ，ナノリットルの反応試薬容積を確保シリコーンゴム一括転写により，製造コストはシンプルなマイクロウェルと同程度細胞ピコリットル細胞捕獲サイトナノリットル反応場 5 製造方法シンプルなマイクロウェルを三次元形状に変更細胞サイズのウェルにより高封入率を確保しつつ，ナノリットルの反応試薬容積を確保シリコーンゴム一括転写により，製造コストはシンプルなマイクロウェルと同程度 PDMS Stereolithography Master Glass substrate Simple peeling 光造形鋳型 10mm Cell Trap 3D Microchambers 転写したPDMS Reagent Reservoir 10mm 6 実際の鋳型と造形物 7 従来技術との比較シンプルなマイクロウェルに対し数百倍もの反応容積を確保マイクロ流体回路技術に対し，構造，製造方法，操作・制御方法がシンプル，ローコストシンプル・低機能シンプル・中機能複雑・高機能 5mm 8 実施例と想定される用途 • 1細胞の封入（分離），酵素反応や薬剤応答試験 • 1細胞遺伝子解析に向けたゲノム増幅反応，RT-PCRの実証試験中 Microchannel inlet bonding 50 μm in height Microchamber Cell Suspension +Reagent PDMS Oil PDMS 9 実施例と想定される用途明視野蛍光視野（細胞を染色） 1細胞アッセイ (アポトーシスの検出) 300μm 1細胞封入効率 300 μm 1細胞のカスパーゼ活性の分布 10 実用化に向けた課題 • 1細胞のトラップ（反応場への封入）とアッセイは安定してできている． • 現在，量産化に向けた製造技術の改良を行っている．鋳型を樹脂製から金属製に変更． • 用途として，1細胞ゲノム増幅やPCRの検証を行っており，これに成功すれば1細胞解析のアプリケーションが増える． 11 企業への期待 • 細胞のアッセイや解析に用いる試薬メーカー等の企業との共同研究を希望 • マイクロ三次元構造転写のノウハウは，他の用途にも応用可能か？ 12 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：マイクロウェルプレート，マイクロウェル装置，細胞解析方法及びマイクロウェルプレートの製造方法 • 出願番号：特願2015-44934 • 出願人：学校法人中央大学国立研究法人理化学研究所 • 発明者：鈴木宏明，岡野太治，城口克之 13 開発② 上皮細胞等の培養細胞を垂直断面で観察できる蛍光顕微鏡観察用マイクロチップ 14 背景培養細胞のイメージングは，細胞がディッシュの底面に広がった状態で行われる→2次元像上皮細胞の極性輸送など，細胞培養面垂直方向の構造や動態が重要なケースがある． 15 従来技術とその問題点細胞構造の三次元情報は今日焦点顕微鏡で取得したスライス像をPC上で再構築して得る →高さ方向の時間・空間解像度が不十分カールツァイス製 LSM (レーザー共焦点顕微鏡） 16 新技術の特徴 • 簡単なサブミリスケールの流路側面に接着細胞を培養 • 流路チップを水平に戻して倒立顕微鏡観察 17 プロトタイプ微分干渉像蛍光像 3D光造型機で試作した縦方向培養容器取得画像例（1スキャン） 10 μm （比較）共焦点再構築像（約40スキャン+画像処理） 18 従来技術との比較 • 接着性培養細胞の断面を，高価な顕微鏡設備を使わず，簡便に，より高解像度で取得可能 • 取得時間は数十分の１ • 細胞培養面垂直方向の動態のライブイメージングが可能に 19 想定される用途 • 細胞生物学の基礎研究 • 創薬，医療の基礎研究 20 実用化に向けた課題 • 基本的なデバイスおよびプロトコルは開発・実証済み • 細胞種によって最適な培養条件が異なるため，様々な細胞種を使ったイメージング事例を重ねる 21 企業への期待 • 細胞イメージング試薬メーカー等の企業との共同研究を希望 22 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：細胞縦断面観察用の顕微鏡観察用部材及び細胞観察方法 • 出願番号：特願2015-6085 • 出願人：学校法人中央大学 • 発明者：鈴木宏明，津金麻実子 23 お問い合わせ先中央大学研究支援室加藤裕幹ＴＥＬ０３−３８１７ − １６０３ＦＡＸ０３−３８１７ − １６７７ e-mail [email protected] 24