Zusammenfassung 6. ZUSAMMENFASSUNG Der reibungslose Ablauf der Spermatogenese ist eine entscheidende Voraussetzung für die Fruchtbarkeit männlicher Säugetiere. Hierbei spielen Sertoli-Zellen eine zentrale Rolle, da sie die Reifung der Keimzellen kontrollieren. Die Aufgaben der Sertoli-Zellen werden dabei u.a. durch FSH reguliert, das von der Hypophyse sezerniert wird. Die FSH-Reaktion der Sertoli-Zellen unterliegt ihrerseits modulatorischer Kontrolle durch Purine, die vermutlich von Sertoli-Zellen selbst sekretiert werden. Dieser autoregulatorische Mechanismus erlaubt eine lokale Feinregulation der hormonellen Antwort innerhalb der Tubuli seminiferi. Bisher sind jedoch sowohl die relevanten purinergen Rezeptoren, als auch die zugrunde liegenden zellulären Signalwege weitgehend unbekannt. In meiner Dissertation habe ich mich daher auf die Aufklärung ATP-vermittelter Signalwege in Sertoli-Zellen der Maus konzentriert. Ich untersuchte zunächst das P2Rezeptorexpressionsprofil im adulten und präpubertären Hoden. Dabei konnte ich die Expression von P2X2-, P2X3-, P2X4-, P2X7-, P2Y1-, P2Y2- und P2Y12-Rezeptoren nachweisen. Davon waren P2X2, P2X7, P2Y2 und P2Y12 spezifisch in Sertoli-Zellen exprimiert. In komplementären und z.T. simultan durchgeführten Ca2+-Imaging- und Patch-ClampExperimenten konnte ich nach ATP-Stimulation sowohl eine Ca2+-Ausschüttung aus internen Speichern, als auch einwärts gerichtete Ströme über die Plasmamembran messen. Meine Ergebnisse zeigen, dass Sertoli-Zellen zwei Arten von ATP-Rezeptoren exprimieren, die in ihrer dynamischen Breite praktisch nicht überlappen. Weiterhin konnte ich zeigen, dass ATP-induzierte Ströme einwärts rektifizierend, langsam desensitisierend und durch Cu2+, Zn2+ und pH-Wert-Änderungen modulierbar sind. Diese Charakteristika beschreiben P2X2 als den physiologisch relevanten ionotropen ATP-Rezeptor in Sertoli-Zellen. Weiterhin habe ich eine potentielle Rolle von Mitochondrien in ATP-induzierten Ca2+Signalwegen in Sertoli Zellen untersucht. In akut präparierten Zellen der transgenen Maus-Linie PhotoTopo® (Axxam Inc.) konnte ich erstmalig Ca2+-Antworten in Mitochondrien von Sertoli-Zellen mittels Biolumineszenz-basierter Live-Cell Imaging 112 Zusammenfassung Experimente untersuchen. Mithilfe pharmakologischer Inhibition der mitochondrialen Ca2+-Aufnahmemechanismen konnte ich nachweisen, dass Mitochondrien in SertoliZellen eine entscheidende Funktion für die Determinierung des Reaktionsprofils sowie der Terminierung zytosolischer Ca2+-Antworten ausüben. Ohne die Ca2+-Pufferung der Mitochondrien sind zytosolische Ca2+-Signale signifikant verlängert. Im Gegensatz dazu wird bei Inhibition der mitochondrialen Ca2+-Abgabe die zytosolische Ca2+-Antwort in ihrer Entwicklung verlangsamt und ihrer Amplitude reduziert. Folglich sind Mitochondrien durch passive Aufnahme und aktive Freisetzung von Ca2+ auch an der Entstehung zytosolischer Signale beteiligt. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass sowohl ionotrope P2X-, als auch metabotrope P2Y-Rezeptoren in Sertoli-Zellen exprimiert werden und verschiedene Sensitivitäten für ATP aufweisen. Demzufolge können Sertoli-Zellen durch die Menge des sekretierten ATPs kontrolliert verschiedene Prozesse regulieren. Das kinetische Profil ATPinduzierter zytosolischer Ca2+-Anstiege wird von Mitochondrien kontrolliert, die in subzellulären Regionen zu sogenannten ‚hotspots‘ akkumulieren. Dies ist möglicherweise notwendig, um Ca2+-Anstiege auf lokale Mikrodomänen zu begrenzen. Räumlich unkontrollierte Ca2+-Anstiege könnten durch Sertoli-Keimzell-Verbindungen (gap junctions) negative Auswirkungen auf verschiedene Stadien der Keimzellreifung haben. Meine Arbeit trägt somit zu einem detaillierten Verständnis regulatorischer Mechanismen bei, die Sertoli-Zellen eine ATP-Rezeptor-vermittelte Kontrolle hormoneller Signale der Hypophyse ermöglicht. 113
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