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12.
HAMBURGER
STUDENTENTAGUNG
Tagungsort:
UNIVERSITÄT HAMBURG
Hörsaal A (Fachbereich Chemie),
Martin-Luther-King-Platz 6,
20146 Hamburg
LIFE
SCIENCE
NORD
8.
Ap
ril
20
15
Veranstalter:
Life Science Nord Management GmbH
Life Science Nord e.V.
Tagungsorganisation:
Life Science Nord Management GmbH
Markus Kräutner
[email protected]
in Kooperation mit:
Prof. Ulrich Hahn (UHH),
Prof. Michael Amling (UKE),
Dr. Michael Hahn (UKE),
Prof. Michael M. Morlock (TUHH),
Prof. Bernd Niemeyer (HSU HH),
Dr. Arne Lorenzen (HSU HH),
Prof. Jürgen Stettin (HAW),
Prof. Friedrich Ueberle (HAW)
Weitere Informationen unter:
www.lifesciencenord.de
Beteiligte Hochschuleinrichtungen:
Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg (HAW)
Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg (HSU HH)
Technische Universität Hamburg-Harburg (TUHH)
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE)
Universität Hamburg (UHH)
Life Science Unternehmen vor Ort!
Gold-Sponsor:
Aussteller:
9.45 - 10.25 Uhr
Block I
Vorsitz: Prof. Dr. Ulrich Hahn
•
Mathematische Modellierung der Epidemiologie
Robin Mathea, HSU HH
•
Eine neue digitale Bildverarbeitungsmethodik, um methanogene Mikrobiome mit
einem Leistungsindex zu objektivieren
Yong-Sung Kim, HAW
•
Methoden des aktiven Lernens für die Klassifikation biologisch aktiver Moleküle
Florian Flachsenberg, Uni HH
Mathematische Modellierung der Epidemiologie
Name: Robin Mathea, Masterstudiengang Maschinenbau/Automatisierungstechnik an der HSU
Betreuer: Herrn Prof. Dr. Armin Fügenschuh von der Professur für Angewandte Mathematik
Studienarbeit – mit anschließender Masterarbeit
Das Ziel meiner Studien- und Masterarbeit ist die mathematische Modellierung von
Epidemien unter der besonderen Betrachtung der möglichen Einflussnahme der
Weltgemeinschaft zur Prävention einer überregionalen Verbreitung und schließlich
flächendeckenden Bekämpfung der jeweiligen Krankheit. Motiviert durch die Expansion des
Ebolavirus und die Unsicherheit der internationalen Gemeinschaft wie den betroffenen
Ländern geholfen werden kann, zielt diese Arbeit auf die Erstellung eines Modells ab, in
welchem sowohl krankheitsspezifische Parameter, als auch topologische, soziale und
infrastrukturelle Besonderheiten berücksichtigt werden. Damit soll im erneuten Ernstfall ein
Modell zur Verfügung stehen, welches die nach Ausbruch der Krankheit zu ermittelnde
Daten vorgibt und auf Grundlage dieser Handlungsoptionen zur Eindämmung der
potentiellen Epidemie vorgibt.
Die Grundlage des zu erarbeitenden Modells ist das SIR-Modell von Kermack und
McKendrick, welches die Bevölkerung in die drei Gruppen gesund (susceptible), erkrankt
(infected) und immun (resistant) einteilt. Anhand dessen können historische
Krankheitsverläufe bereits gut wiedergegeben werden. Zwischen den einzelnen
Bevölkerungsgruppen bestehen nichtlineare Zusammenhänge, die insgesamt ein
dynamisches System bilden, diese Zusammenhänge werden mit Differentialgleichungen
beschrieben. Zur Lösung des DGL-Systems wird im Rahmen dieser Arbeit die Software
Vensim benutzt, welche als freie Software jedermann unentgeltlich zur Verfügung steht.
Das SIR-Modell beschreibt die Bevölkerung als homogene Masse, dies gilt es noch zu
spezifizieren. Sowohl hinsichtlich sozialer Aspekte wie Alter und sozialem Stand, als auch
topologischer und infrastruktureller Faktoren wie Vernetzung zwischen Ballungszentren und
dem Austausch zwischen Stadt und Landbevölkerung. Damit sollen mehrere
Bevölkerungsgruppen mit ähnlichem Bewegungsprofil modelliert werden, welche der
Krankheit mit unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten ausgesetzt sind. Dadurch lässt sich
auch der zu erwartende Erfolg von Maßnahmen wie zum Beispiel dem Impfen von
Risikogruppen, Ausgangssperren oder Schließungen von Bahnhöfen und Flughäfen
regionalspezifisch bewerten.
Ein wichtiger Gesichtspunkt bei der raschen Hilfe zur Bekämpfung einer sich anbahnenden
Epidemie ist deshalb Kenndaten zu benennen, die frühzeitig gesammelt werden können und
aussagekräftig für den möglichen Verlauf der Krankheit sind, um damit das Übergreifen auf
benachbarte Regionen zu verhindern und die Anzahl an Erkrankten möglichst gering zu
halten.
Da ich die Arbeit erst vor kurzem übernommen habe, liegen aktuell leider noch keine
Ergebnisse vor.
Eine neue digitale Bildverarbeitungsmethodik, um methanogene
Mikrobiome mit einem Leistungsindex zu objektivieren
Name: Yong Sung Kim (Doktorand)
Fachgebiet: Biotechnologie, HAW-Hamburg
Betreuer: Paul Scherer, HAW-Hamburg
Abstract
Mikroorganismen bewirken mit Pflanzen, Pilzen und Tieren einen Kohlenstoffkreislauf. Ein
prominentes Beispiel aus der Biotechnologie ist die anaerobe Abwasserreinigung von
Abwässern oder die Biomethanisierung von organischen Reststoffen. Für den
Biotechnologen ist es wichtig, zu überprüfen, ob der Prozess gut und stabil läuft, um ihn
dann ggf. zu optimieren. Eine biologische Vielfalt (Biodiversität) fördert die Stabilität des
Ökosystems aller lebenden Organismen und es ergab sich daher die Frage, diese Diversität
statt klassisch morphologisch oder molekularbiologisch mit einer optischen Methode schnell
und kostengünstig zu erfassen. Solche Methoden dienen auch der Krebsvoruntersuchung,
hier geht es aber um Mikroorganismen, die gut eine Zehnerpotenz kleiner sind als
Krebszellen, etwa in der Größe von Zellorganellen, dazu noch lebendig, also mobil. Deshalb
wurde mit dieser Arbeit echtes Neuland betreten. Ein bakterieller Abbauprozess im
Nahrungszyklus findet unter Beteiligung zahlreichen Arten von Mikroorganismen statt. Daher
sollte ein Mikrobiom ebenso wie eine Population höherer Organismen umso stabiler und
leistungsfähiger sein, je höher die Diversität ist (vgl. „hartnäckige Infektion“). Für die
Überprüfung dieser Hypothese wurden eine Bildverarbeitungsmethode und eine
mathematische Formel entwickelt, um sie am Beispiel methanogener Prozesse anzuwenden.
In die Leistungsbeschreibung eines methanogenen Mikrobioms sollte über eine SYBR
Green-Färbung die quantitative Anzahl der Mikroorganismen (Bakterien und Archaea) sowie
über eine gesonderte, spezifische Fluoreszenz die Aktivität der Methanbildner eingehen. Die
methanogene Aktivität wurde über die Leuchtstärke der charakteristischen Autofluoreszenz
dieser Zellen mit Licht von 420 nm bestimmt, wobei jede lebende Zelle einzeln bei hoher
Vergrößerung unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet wurde. Eine Klassifizierung der
Bakterien in verschiedene Morphodiversitätsklassen erfolgte mit selbst erstellten BildAlgorithmen. Dadurch konnte ein Simpson-Diversitätsindex erstellt werden, wie er sonst
auch in der Molekularbiologie verwendet wird. Ebenfalls ging in die Auswertungsformel als
metabolischer Wert die Konzentration der Metaboliten in Form der Gesamtsäure in den
Proben ein, ferner der TS-Gehalt der Probe, die leicht zu bestimmen sind. Wir haben diesen
Index als Quantitativen Mikroskopischen Fingerabdruck Index (QMFI) bezeichnet. Die
Abhängigkeit des QMFI von den einzelnen Einflussgrößen wurde simuliert. Der QMFI konnte
für viele Proben verschiedenen Ursprungs (Kläranlage, Biogasanlagen) eingesetzt werden
und zeigte als Indikator für Umsatzleistung und Biodiversität plausible Werte.
.
Methoden des aktiven Lernens für die Klassifikation biologisch aktiver
Moleküle
Florian Flachsenberg, Betreuer: Prof. Dr. Matthias Rarey
Master-Arbeit im Fachgebiet Chemieinformatik, entstanden am Zentrum für Bioinformatik der
Uni HH
Bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt die Identifikation bioaktiver Verbindungen eine
entscheidende Rolle. Hierfür kommen oft Hochdurchsatz-Methoden zum Einsatz, die sehr
viele Moleküle auf ihre biologische Aktivität untersuchen. Hierzu zählen High-ThroughputScreening Experimente im Labor und das virtuelle Screening von Molekülen im Computer,
welche beide tausende potentiell aktiver Verbindungen ausgeben.
Die erhaltene Molekülmenge muss anschließend analysiert werden. Forscher interessieren
dabei beispielsweise folgende Fragestellungen: Welche Gemeinsamkeit haben die aktiven
Verbindungen? Welche Eigenschaften sind für die Bindung an ein Zielprotein essentiell?
Haben alle Moleküle denselben Bindungsmodus? Eine typische Vorgehensweise ist es
hierbei, die Moleküle in Gruppen einzuteilen. Diese Einteilung wird typischerweise von Hand
durch einen Experten oder mit automatischen Cluster-Verfahren vorgenommen. Beide
Verfahren haben entscheidende Nachteile: Die manuelle Einteilung ist sehr zeit- und
arbeitsaufwendig. Automatische Gruppierungen hingegen sind zwar sehr einfach und schnell
durchzuführen, individuelle Anforderungen an die Einteilung können aber weder flexibel noch
direkt integriert werden.
Als Lösung für dieses Problem stellen wir hier ein halbautomatisches Verfahren zur
Einteilung von Molekülen vor. Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, dass es das Wissen
und die Intuition des Anwenders berücksichtigt und außerdem den Großteil der Moleküle
automatisch einteilt. Der Ansatz hat das Potential den Arbeitsaufwand im Vergleich zu einer
manuellen Einteilung erheblich zu reduzieren, während es dabei vergleichbare Ergebnisse
liefert.
Methoden Als zentrales Element für ein halbautomatisches Verfahren wurden aktive
Lernverfahren betrachtet, die versuchen folgende Frage in einem interaktiven Vorgang zu
beantworten: Welche Moleküle können bereits automatisch einer Gruppe zugeordnet werden
und bei welchen muss der Anwender gefragt werden? Ein maschinelles Lernverfahren lernt
die vorgegebene Einteilung und kann damit die verbleibenden Moleküle automatisch
klassifizieren. Ziel ist es, dass der Anwender für möglichst wenige Moleküle die Gruppe
vorgeben muss
Die aktiven Lernverfahren wurden dahingehend evaluiert, wie viele Moleküle bei intelligenter
(aktiver) Auswahl manuell eingeteilt werden müssen, damit eine vergleichbare Qualität wie
bei vollständiger Gruppierung von Hand erreicht werden kann. Die aktive Auswahl der
Moleküle zur Einteilung durch den Anwender wurde mit einer zufälligen Auswahl der
Moleküle verglichen. Die zufällige Auswahl entspricht der Einteilung einer beliebig gewählten
Teilmenge der Moleküle durch den Experten. Auf verschiedenen Datensätzen mit bekannter
Einteilung wurde die Auswahl mit beiden Strategien simuliert. Als Maß wurde die
Genauigkeit der automatischen Einteilung der noch nicht gruppierten Moleküle verwendet.
Dieses Maß wurde in Abhängigkeit der Anzahl manuell eingeteilter Moleküle betrachtet.
Ergebnisse Zur Validierung unseres Ansatzes wurde die Leistungsfähigkeit des aktiven
Lernens auf 23 Datensätzen mit 382–4966 Molekülen gemessen. Bei gleicher Anzahl
Moleküle mit bekannter Gruppe wird die Einteilung der nicht gruppierten Moleküle deutlich
öfter korrekt vorhergesagt, wenn die gruppierten Moleküle aktiv ausgewählt wurden. Um den
gleichen Anteil der übrigen Moleküle korrekt zu gruppieren, muss bei aktiver Auswahl der
Anwender seltener nach der Gruppe gefragt werden. In den meisten Fällen muss deutlich
weniger als die Hälfte der Moleküle manuell klassifiziert werden, um die tatsächliche
Einteilung der übrigen Moleküle nahezu perfekt vorherzusagen.
Schlussfolgerung Die Verwendung aktiver Lernverfahren kann folglich die Anzahl der
Moleküle erheblich reduzieren, für die eine Benutzereingabe erforderlich ist.
Halbautomatische Klassifikationsverfahren, die auf aktiven Lernverfahren basieren, stellen
eine interessante Alternative zur zeitaufwendigen manuellen Einteilung dar. Offene
Fragestellungen sind die Evaluierung des Verfahrens auf weiteren Datensätzen und
insbesondere die Integration des Ansatzes in einen interaktiven Workflow.
11.00 - 11.40 Uhr
Block II
Vorsitz: Prof. Dr. Michael Amling, Dr. Michael Hahn
•
Entwicklung eines reinraumtauglichen Drehmoduls für die Mikrozerspanung
Niklas Kampe, HSU HH
•
Spezifische RNA Inhibition von innovativen Target Genen als neuer Therapieansatz
für Präeklampsie
Julia Bercher, Uni HH
•
Molekulare Untersuchungen zur Differenzierung von Gelenkknorpel-Chondrozyten
Martin Bonitz, UKE
Abstract - Entwicklung eines reinraumtauglichen Drehmoduls für die Mikrozerspanung
Name Student:
Name Betreuer:
Bachelor-Thesis:
Manufacturing
Niklas Kampe
Univ.-Prof. Dr.-Ing. Jens Wulfsberg
Entwicklung eines Drehmoduls im Geltungsbereich des Square Foot
Ziel
Der branchenübergreifende Bedarf an miniaturisierten Präzisionsbauteilen, insbesondere im
Bereich der Medizintechnik, erfordert die Entwicklung neuartiger Module für die
Mikrozerspanung. Bestehende modulare Bearbeitungssysteme sollen um ein Modul erweitert
werden, welches die rotatorische Positionierung in Kombination mit Zerspanungsprozessen
ermöglicht.
Methoden
Die Entwicklung des Drehmoduls basiert methodisch auf dem Produktentstehungsprozess
der VDI-Richtlinie 2221. Die Anforderungen an die Produktentwicklung wurden um die
Besonderheiten der Mikrofertigungstechnik ergänzt. Aus möglichen Konzepten wurde im
Bezug auf die Erfüllung und Erweiterung der durch den Stand der Forschung vorgegebenen
Anforderungen eine Lösung ausgewählt.
Ergebnisse
Ergebnis der Arbeit ist das Entwicklungskonzept eines Drehmoduls, welches durch
hochpräzise Piezoaktorik in Kombination mit einer geeigneten Ansteuerung in der Lage sein
wird, die institutsintern entwickelte Spannvorrichtung rotatorisch zu positionieren. Dabei sind
die Besonderheiten der Mikrofertigung im Entwicklungsprozess berücksichtigt worden.
Schlussfolgerung
Das entwickelte Drehmodul ermöglicht die hochgenaue rotatorische Positionierung von
Bauteilen für die spanende Bearbeitung in Reinraumumgebung. Es erweitert somit die
Bearbeitungsmöglichkeiten für den stetig steigenden Bedarf an individualisierten
Präzisionsbauteilen, wie beispielsweise den Werkzeugen der minimalinvasiven Chirurgie.
Abbildung 1: Drehmodul für die Mikrozerspanung
Spezifische RNA Inhibition von innovativen Target Genen
als neuer Therapieansatz für Präeklampsie
Julia Katharina Bercher
MLS Bachelor-Thesis der Fachhochschule Nordwestschweiz
Betreuung durch Prof. Dr. Veronika Butterweck
Präeklampsie ist eine Multisystem Erkrankung der Schwangerschaft, welche durch das
Neuauftreten von Hypertonie und Albuminurie im dritten Trimenon der Schwangerschaft
definiert ist. Präeklampsie bringt schwerwiegende Folgen für Mutter und Fetus mit sich und
ist eine der Hauptursachen maternaler und fetaler Morbidität, als auch Mortalität. Die
Mechanismen zur Entstehung der Krankheit sind noch nicht vollständig verstanden. Neben
einer genetischen Komponente, sind eine Dysregulation des Renin-Angiotensin-Systems
und eine anti-angiogenetische Dysbalance als mögliche Ursachen identifiziert worden. Ein
mangelhafter Remodeling Prozess und eine reduzierte Trophoblasteninvasion, scheinen als
Folge einer unzureichend perfundierten Plazenta ebenfalls involviert zu sein.
Bis zum heutigen Zeitpunkt gibt es keine medikamentöse Heilung für die Präeklampsie.
Lediglich die zeitnahe Geburt, einhergehend mit der Entbindung der Plazenta, führt zur
raschen Einstellung der Beschwerden. Die Einleitung der Geburt ist jedoch mit erheblichen
Komplikationen der Frühgeburtlichkeit assoziiert. Eine klassische medikamentöse Therapie
um das Renin-Angiotensin-System zu hemmen, wie zum Beispiel mit ACE Hemmer oder
AT1 Rezeptorantagonisten, sind auf Grund von fetalen Nebenwirkungen strikt kontraindiziert.
Die RNA Interferenz Therapie stellt daher eine neue innovative Möglichkeit zur spezifischen
Inhibition von involvierten Zielgenen dar. Großer Vorteil dieser Therapie ist eventuell, dass
aufgrund der Größe der Therapiekonstrukte die Überschreitung der Plazentaschranke nicht
möglich ist.
Ziel der Arbeit war es, die Verabreichung einer siRNA für Angiotensinogen in einem
etablierten Rattenmodell für Präeklampsie zu testen und den Effekt auf tierphysiologischer,
molekularbiologischer und histologischer Grundlage zu untersuchen. Die Untersuchung der
physiologischen Parameter hat ergeben, dass die charakteristische Hypertonie und
Albuminurie der trächtigen präeklamptischen Tiere durch die RNA Interferenz Therapie
reduziert werden konnte. Außerdem zeigte sich, dass das Gewicht der Feten durch die
Therapie erhöht wird, sowie die Wachstumsretardierung der Feten geringer wird. Auf
molekularbiologischer Ebene konnte die hohe Effizienz der RNA Inhibition nachgewiesen
werden. Die Angiotensinogen Expression in Leber und Niere wurde signifikant reduziert. Die
Quantifizierung des anti-angiogenetischen Faktors sFLT1 ergab ebenfalls eine geringere
Expression in den behandelten präeklamptischen Ratten. Die histologischen Ergebnisse
zeigten ein signifikant größeres Labyrinth in behandelten präeklamptischen Tieren. Folglich
ergibt sich auch eine größere Plazentafläche, welche die Erklärung für eine verbesserte
Qualität des Nährstoffaustausches zwischen Mutter und Fetus sein könnte.
Unter Einbezug aller Ergebnisse kann die RNA Interferenz als innovativer Ansatz zur
Behandlung der Präeklampsie angesehen werden. Dennoch sind weitere Untersuchungen
zwingend nötig. Insbesondere zur Fragestellung, ob der Fetus mit dem Therapiekonstrukt in
Kontakt kommt oder ob die Plazentaschranke dies effektiv verhindert.
Molekulare Untersuchungen zur Differenzierung von
Gelenkknorpel-Chondrozyten
Martin Bonitz
Universitätsklinikum Eppendorf, Prof. Schinke und Prof. Amling
Ziel
Die Arthrose ist mit einer Lebenszeitprävalenz von über 20% eine der bedeutendsten
Erkrankungen mit großer volkswirtschaftlicher Bedeutung. Dennoch gibt es bis dato keine
kausale Therapie, was auf ein fehlendes Verständnis der Gelenkknorpel-Regulation
zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit soll das Gelenk als gesamtes Organ betrachtet
und das Zusammenspiel von Synoviozyten (Gelenkkapselzellen) und Chondrozyten
(Knorpelzellen) auf molekularer Ebene untersucht werden. Durch Erkenntnisse bezüglich
dieser Interaktion sollen neue kausale Therapieoptionen erwachsen.
Methoden
Porcine Chondrozyten werden in Zellkultursystemen mit Synoviozyten-konditioniertem
Medium behandelt. Zur Untersuchung werden qRT-PCR-Analysen sowie eine GenchipAnalyse durchgeführt. Zur Identifizierung möglicher synovialer Knorpelregulatoren werden
Methoden der HPLC und der Proteomanalyse angewandt. Desweiteren werden im Serum
von Arthrosepatienten spezifische Gelenkknorpelmarker per ELISA bestimmt, um mögliche
Biomarker zu identifizieren. Außerdem wird in Zusammenarbeit mit der TUHH eine
Qualitätskontrolle von in vitro-gezüchtetem Knorpel durchgeführt (Tissue Engineering).
Ergebnisse
Verschiedene Gene der artikulären Chondrozyten werden durch das Synoviozytenkonditionierte Medium beeinflusst. Von besonderer Bedeutung sind in diesem Fall Gene, die
für die zwei Hauptbestandteile der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpels (COL2A1,
ACAN) codieren, sowie weitere Gene, die eine Rolle in der Entstehung der Arthrose haben
könnten, z.B. SDC4 (Echtermeyer et al. 2009). Während Syndecan-4 bereits nach sechs
Stunden signifikant verstärkt exprimiert wird, folgt nach 24 Stunden eine signifikant
verringerte Expression von ACAN und COL2A1. Dies erklärt sich u.a. dadurch, dass in Folge
der SDC4-Amplifikation mehr MMP3 exprimiert wird, welches eine entscheidende Rolle im
Abbau der extrazellulären Matrix einnimmt. Diese Regulation wurde durch eine GenchipAnalyse bestätigt.
Mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation und HPLC konnte dieser Effekt isoliert werden.
Schlussfolgerung
Das typische Korrelat der Arthrose sind Schäden des Gelenkknorpels. Jener ist nicht
durchblutet und wird durch die Gelenkflüssigkeit versorgt, welche sich aus Filtrat von Blut
und zusätzlich Produkten der die Gelenkhöhle auskleidenden Synoviozyten.
In dieser Arbeit können wir zeigen, dass die Synoviozyten eine große Rolle in der Regulation
des Gelenkknorpels spielen, respektive einen katabolen Effekt haben. Dies ist dahingehend
interessant, da diese Erkenntnis dafür spricht, dass bereits unter physiologischen
Bedingungen Knorpelmatrix degradiert wird. Sollten sich diese Effekte bestätigen, würden
sich neue Therapieoptionen eröffnen, indem man die Synoviozyten als neues Ziel für
Medikamente wählt.
12.20 - 13.00 Uhr
Block III
Vorsitz: Dr. Arne Lorenzen
•
Entwicklung und Evaluierung einer Gestensteuerung für roboter-assistierte
Operationsmikroskope
Christian Sonnenburg, TUHH
•
Etablierung eines Fließkammerbioreaktors zur Kultivierung von Fibroblasten
Sandra Burghardt, HAW
•
Crtc1 -/- Mäuse zeigen kardiale Hypertrophie und verminderte RGS2 Level
Karoline Morhenn, UKE
Gestensteuerung eines roboter-assistierten Operationsmikroskopes
Christian Sonnenburg, [email protected], Studiengang: Mechatronics, Betreuer:
Sven-Thomas Antoni, TU Hamburg-Harburg, Institut für Medizintechnische Systeme,
[email protected], Master-Thesis
Ziel der Arbeit ist die Entwicklung eines Systems zur Positionierung von Operationsmikroskopen
mittels Handgesten. Die Positionierung herkömmlicher Operationsmikroskope wird in der Regel
manuell durchgeführt. Motorisierte Mikroskope besitzen hingegen Fußpedale oder Mundschalter.
Handgesten könnten eine intuitivere und variablere Interaktion ermöglichen. Dies könnte den
Umgang mit Operationsmikroskopen hinsichtlich der Ergonomie, der kognitiven Beanspruchung
des Nutzers und der Wahrung der Sterilität im OP Bereich vereinfachen.
Im Rahmen der Arbeit wird unter der Berücksichtigung der spezifischen Anforderungen an die
Bedienung von Operationsmikroskopen prototypisch eine Positionssteuerung für den Endeffektor
eines Roboterarms (UR5, Universal Robots, Dänemark) entwickelt. Dafür wird ein auf die
Erkennung von Handposen spezialisiertes Kamerasystem (Leap Motion Controller, Leap Motion
Inc, USA) auf dem Endeffektor angebracht. Die Daten des Kamerasystems werden genutzt, um
definierte Gesten und die Position einer Hand im Sensorfeld zu erkennen. Darauf basierend wird
der Endeffektor des Roboterarms entsprechend positioniert. Um Aussagen über die
Anwendungsmöglichkeiten eines solchen Systems treffen zu können, wird der Leap Motion
Controller bezüglich seiner Wiederholpräzision bei der Positionsbestimmung verschiedener
Messpunkte an einer Modellhand in verschiedenen Konfigurationen untersucht. Die Position der
Hand relativ zum Sensor, die Handhaltung und die Intensität externer Lichtquellen werden
variiert. Daraufhin werden möglichst einfache und robuste Gesten identifiziert. Das fertig
entwickelte und kalibrierte System wird mit Hilfe von Testpersonen evaluiert. Dabei wird
besonders das Tracken einer Hand über einen vorgegebenen Pfad hinweg untersucht. Der Pfad
wird währenddessen mit einem digitalen Mikroskop erfasst. Um objektivere Ergebnisse zum
Tracking-Verhalten erzielen zu können, werden zusätzlich Versuche mit einer Modellhand,
welche an einem weiteren Roboterarm bewegt wird, durchgeführt.
Die Ergebnisse der Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen. Die Wiederholpräzision der
Positionsbestimmung variiert stark über die einzelnen Messpunkte an der Modellhand sowie über
die einzelnen Konfigurationen. Es werden Werte zwischen 1,2 mm und 302,2 mm erhalten. Die
Wiederholpräzision zeigt teilweise starke Abhängigkeiten von der Handhaltung. Mit einer
durchschnittlichen Wiederholpräzision von 14,8 mm über alle Konfigurationen kann der
Mittelpunkt der Handfläche mit am zuverlässigsten erfasst werden. Dieser Messpunkt wird für die
folgenden Experimente zur Positionsbestimmung der Hand festgelegt. Ausgestreckte Finger und
eine horizontale Handhaltung über dem Sensor verbessern die Präzision. Die weiteren Versuche
zur Evaluation des entwickelten Systems werden in dieser Konfiguration durchgeführt. Gesten,
die Fingerbewegungen beinhalten, werden nur unzuverlässig erkannt. Distanzen zwischen
gemessenen Positionen der Modellhand zeigen überdurchschnittliche absolute Fehler in bis zu
20% der Messungen. Bei einer Messfrequenz von 110 Hz, die das entwickelte System erreicht,
kann der Endeffektor einer erfassten Modellhand mit einem mittleren quadratischem Fehler
zwischen 6.8 mm und 13.9 mm folgen. Testpersonen haben selten Schwierigkeiten, den
Endeffektor per Hand entlang eines vorgegebenen Pfades zu navigieren. Knapp 2/3 aller
Teilnehmer erreichen relative Pfadabweichungen von unter 5%. Die Präzision der
Positionsbestimmung weist nur eine geringfügige Abhängigkeit von der Intensität der
verwendeten externen Lichtquelle auf.
Als Fazit können hauptsächlich zwei Aussagen getroffen werden. Erstens kann ein
Operationsmikroskop an einem Roboterarm zuverlässig und intuitiv mittels Handtracking
positioniert werden. Zweitens ist eine zuverlässige Erkennung differenzierter Gesten mit dem
Leap Motion Controller im derzeitigen Entwicklungsstadium noch nicht möglich. Es wird daher
empfohlen, die Zuverlässigkeit der Erkennung durch eine Vorverarbeitung der Rohdaten zu
erhöhen.
Bonn, den 05.04.2015
Etablierung eines Fließkammerbioreaktors zur Kultivierung von Fibroblasten
Name:
Sandra Burghardt
Fachgebiet:
Biotechnologie
Betreuer:
Dipl.-Ing. Grit Blume, Prof. Dr.-Ing. Ralf Pörtner, Prof. Dr.-Ing. Holger Mühlberger
Abstract Bachelor-Thesis
Wirkstoffscreenings mit tierischen Zellkulturen erfolgen klassischer Weise statisch in
Multiwellplatten in Form von Endpunktanalysen. Um die Zuverlässigkeit der Tests zu
verbessern, müssen konstante Wachstumsbedingungen während der gesamten Kultivierung
und Methoden zur on-line Erfassung von Zellzahl und Zellviabilität realisiert werden.
Vor diesem Hintergrund wurde am Institut für Bioprozess- und Biosystemtechnik der
Technischen Universität Hamburg-Harburg ein Fließkammerbioreaktor entwickelt. Im
Reaktor können adhärent wachsende Zellen unter Perfusion kultiviert werden. Auf diese
Weise soll eine kontinuierliche Versorgung der Zellen bei gleichzeitigem Abtransport der
Metabolite erreicht werden. Das System ist im Format einer 24-Well-Platte gefertigt und
somit leicht in die Standardroutinen der Zellkultur einzubinden. Der modulare Aufbau des
Reaktors ermöglicht zudem die Integration von Folienelektroden.
Für die Etablierung des Fließkammerbioreaktors kamen die murinen Fibroblasten L929 zum
Einsatz. Die Zellen wurden sowohl unter statischen Bedingungen als auch unter Perfusion
auf PET-Folien im Reaktor kultiviert. Das Zellwachstum konnte über eine Analyse der
Zellzahlen sowie der Glucose- Lactat- und Sauerstoffkonzentrationen im Medium erfasst
werden.
Es hat sich in diesem Zusammenhang herausgestellt, dass die Überströmungsgeschwindigkeit ein kritischer Parameter ist. Die Zellen ändern bei zu hohen Pumpraten nicht
nur ihre Morphologie, sondern werden auch von der Kultivierungsoberfläche abgelöst. Nach
einer
stufenweisen
Reduktion
der
Pumprate
konnte
eine
geeignete
Überströmungsgeschwindigkeit gefunden werden, bei der in Bezug auf das Zellwachstum
kein Unterschied mehr zwischen statischer und perfundierter Kultur festzustellen war. Die
Perfusion
führte
zu
konstanten
Substratund
Produktkonzentrationen
im
Kultivierungszeitraum.
Des
Weiteren
erfolgte
die
Fertigung
von
Interdigitalelektroden
für
die
Impedanzspektroskopie, welche in den Reaktor eingebaut werden können. Diese
ermöglichen die kontinuierliche und non-invasive Erfassung von Zellzahl sowie der
Zellviabilität über das Phänomen der β-Polarisationsrelaxation. Die Elektroden wurden mit
mikrosystemtechnischen Methoden im Reinraum hergestellt und werden demnächst für erste
Messungen eingesetzt. Langfristig gesehen sollen die Elektroden in dreidimensionale
Zellkulturen integriert werden sowie die Entwicklung weiterer Sensoren erfolgen.
Crtc1-/- Mäuse zeigen kardiale Hypertrophie und verminderte RGS2 Level
K. Morhenn1,2, B. Geertz3, T. Eschenhagen2,3, J.-R. Cardinaux4, S. Lutz5,6, E. Oetjen1,2,7
1)
Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf, Martinistraße 52,
2)
20246 Hamburg Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, Standort Hamburg/Kiel/Lübeck
3)
Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf,
4)
Martinistraße 52, 20246 Hamburg Centre de Neurosciences Psychiatriques, Hôpital de Cery, 1008 Prilly5)
Lausanne, Schweiz Institut für Pharmakologie, Universitätsklinikum Göttingen, Robert Koch Straße 40, 37075
6)
7)
Göttingen Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, Standort Göttingen Institut für Pharmazie,
Universität Hamburg, Bundesstraße 45, 20146 Hamburg
Einleitung/Ziel
Maladaptive Herzhypertrophie führt zu Herzinsuffizienz, eine der häufigsten Ursachen für
einen stationären Krankenhausaufenthalt in der westlichen Welt. Die lebensverlängernde
Wirkung der β-Adrenozeptorantagonisten zeigt, dass β-Adrenozeptor-abhängige
Mechanismen zu der Pathogenese der Hypertrophie beitragen. Agonisten dieser Rezeptoren
führen in Kardiomyozyten zu der Aktivierung cAMP- und calciumabhängiger Signalwege und
der Phosphatase Calcineurin. Der cAMP Regulated Transcriptional Coactivator 1 (CRTC1)
wird durch den Anstieg von cAMP und Calcium/Calcineurin reguliert (Bittinger et al., 2004).
Es ist bekannt, dass der Regulator of G-Protein Signaling 2 (RGS2) eine Hypertrophie durch
die Reduzierung von G αq -Protein gekoppelten Signalwegen vermindert (Xie et al, 2011;
Zhang und Mende, 2013) und seine Gentranskription durch CREB induziert wird. Unsere
bisherigen Daten zeigen, dass der Proteingehalt von CRTC1 im Herzen von Mäusen und
Menschen mit maladaptiver Hypertrophie erhöht ist. In diesem Projekt wurde die Rolle von
CRTC1 für die Pathogenese der Herzhypertrophie, unter anderem durch die Regulierung
von RGS2, untersucht.
Methoden
RT-qPCR, Immunoblot-Analyse, Echokardiografie, transiente Transfektion in HEK-Zellen,
Reportergenassay, Chromatinimmunpräzipitation
Ergebnisse
Es wurden Mäuse untersucht, in welchen Crtc1 ubiquitär deletiert wurde. Crtc1 mRNA- und
Protein-Level waren nicht nachweisbar. Crtc2 und Crtc3 mRNA-Level blieben in den Crtc1-/Mäusen unverändert verglichen mit ihren Wildtyp-Geschwistertieren. Die Crtc1-/- Mäuse
wiesen Zeichen einer Hypertrophie auf, gemessen an einem erhöhten Verhältnis von
Herzgewicht zu Tibialänge und einer erhöhten Größe der Kardiomyozyten.
Echokardiografische Untersuchungen zeigten eine verminderte Ejektionsfraktion, eine
verminderte Verkürzungsfraktion und ein vermindertes Herzzeitvolumen verglichen mit den
Wildtyp-Geschwistertieren. In Crtc1-/- Mäusen wurden verminderte Rgs2 mRNA- und ProteinLevel gemessen, während die mRNA-Level von Rgs3, Rgs4, Rgs5 und Rgs6 unverändert
blieben. Die Hypertrophiemarker Nppa, Nppb, Acta1 und Myh7 zeigten keine Veränderung
auf mRNA Ebene.
In HEK-Zellen konnte die Stimulation der transkriptionellen Aktivität des RGS2-Promoters
durch
CRTC1
gezeigt
werden.
In
murinem
Herzgewebe
konnte
per
Chromatinimmunpräzipitation gezeigt werden, dass auch endogenes CRTC1 an den RGS2
Promoter rekrutiert wird.
Schlussfolgerung
Unsere Daten zeigen, dass Crtc1-/- Mäuse eine verminderte Herzfunktion aufweisen. Durch
eine Steigerung der Genexpression von Rgs2 und die vermutlich daraus folgende
Verminderung von Hypertrophiesignalen, scheint CRTC1 vor einer maladaptiven
Herzhypertrophie zu schützen. Somit könnte CRTC1 ein neuartiges Ziel für die Behandlung
der Herzhypertrophie darstellen.
14.30 - 15.10 Uhr
Block IV
Vorsitz: Prof. Dr. Michael Morlock
•
Finite Elemente Simulation des Dispersionsverhaltens biologischer Zellen mit Hilfe der
Schwarzschen Gebietszerlegung
Fabian Scharf, HSU HH
•
Anti-Tumor-Wirkung von synthetischen membranlysierenden Peptiden
Dominik Wilms, HAW
•
Studien zur Synthese und Biosynthese von Annonin-Naturstoffen
Juliane Adrian, Uni HH
Finite Elemente Simulation des Dispersionsverhaltens biologischer Zellen mit Hilfe
der Schwarzschen Gebietszerlegung
Fabian Scharf, Sebastian Böhmelt, Yannic Eichler, Marcus Stiemer
1) Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg
Die Beeinflussung menschlichen Gewebes durch elektromagnetische Felder wird heutzutage
gezielt in der Biomedizin eingesetzt. Durch die sogenannte Elektroporation kann man
beispielsweise Ionen und Moleküle in das Zellinnere transferieren. Als weitere Beispiele sind
die Elektrophorese zu nennen oder die Trennung verschiedener Zellen im inhomogenen
elektrischen Feld infolge unterschiedlicher Dipolmomente, die erzeugt werden durch auf der
Zelloberfläche influenzierte Ladungen.
Alle aufgezeigten Effekte zeigen ein dispersives, d.h. frequenzabhängiges Verhalten. Daher
hängen sowohl die makroskopischen als auch die mikroskopischen Auswirkungen eines
elektrischen Wechselfeldes auf biologisches Gewebe von der Frequenz ab. Eine spezielle
Auswirkung ist z.B. die Polarisation von Zellen im Frequenzbereich von 10 kHz – 10 MHz (βDispersion). Ursache hierfür ist das Ausbilden eines kapazitiven Feldes über der
Zellmembran. Ladungsträger bzw. Ionen lagern sich sowohl an der Grenzschicht zwischen
Membran und extrazellulärer Lösung als auch zwischen Membran und Zellinnerem an. Kehrt
sich das elektrische Feld um, bewegen sich die Ladungsträger in die entgegengesetzte
Richtung. Dem Relaxationsverhalten des kapazitiven Systems entsprechend, kommt es zu
einem periodischem Auf- und Abbau von Oberflächenladungen. Die Beschreibung dieses
durch Ladungsrelaxation bestimmten Systems erfolgt durch eine elektroquasistatische
Formulierung der Maxwell-Gleichungen.
In der Simulation wird ein System aus Zellinnerem, Zellmembran und extrazellulärer
Elektrolytlösung betrachtet. Die numerische Herausforderung im Rahmen der FiniteElemente-Methode (FEM) liegt einerseits in der Implementierung der Interface-Bedingungen,
die den Aufbau von Flächenladung im elektroquasistatischen Modell bestimmen, und
andererseits in den Skalenunterschieden zwischen der gesamten Zelle (∼ 20 µm) und der
Zellmembrandicke (∼ 10 nm). Daher wird in dieser Arbeit ein Gebietszerlegungsverfahren
eingesetzt, das auf der alternierenden Schwarzschen Gebietszerlegung basiert und so
modifiziert wird, dass die Übergangsbedingungen für Stromdichte und elektrische
Flussdichte in den einzelnen Iterationsschritten des Verfahrens realisiert werden.
Im Gegensatz zum globalen Finite-Elemente-Verfahren, bei dem das gesamte Gebiet
diskretisiert wird, und das resultierende Gleichungssystem für alle Freiheitsgrade gleichzeitig
gelöst wird, arbeitet das vorgestellte Verfahren mit kleineren lokalen Steifigkeitsmatrizen, da
für jedes Teilgebiet der Zerlegung einzeln gelöst wird. Da bei Einsatz eines typischen
Gleichungslösers die Zeit zum numerischen Lösen der partiellen Differentialgleichung nichtlinear von der Problemgröße abhängt, kann beim iterativen Gebietszerlegungsansatz eine
deutliche Zeitersparnis im Vergleich zum globalen Verfahren festgestellt werden. Zudem ist
durch die Gebietszerlegung eine parallele Lösung in den einzelnen Teilgebieten möglich,
was eine deutliche Reduktion der Rechenzeit bewirkt. Insbesondere kann somit ein System
mit einer Vielzahl von Zellen effizient simuliert werden.
Erste Ergebnisse konnten für eine vereinfacht modellierte Zelle ohne Organellen erzielt
werden. Der Verlauf der Zellpolarisation bei Anregung durch ein Wechselfeld im
Frequenzbereich von 10 kHz – 10 MHz wurde in der Simulation qualitativ richtig
wiedergegeben.
Anti-Tumor-Wirkung von synthetischen membran-lysierenden Peptiden
Dominik Wilms1, Claudia Maletzki2, Michael Linnebacher2, Thomas Gutsmann3, Jörg Andrä1,3
1
Department Biotechnologie, Hochschule für Angewandte Wissenschaften (HAW) Hamburg
AG Molekulare Onkologie und Immuntherapie, Universitätsklinikum Rostock
3
AG Biophysik, Leibniz-Zentrum für Medizin und Biowissenschaften, Borstel
2
Einleitung: Die klassische Krebstherapie geht mit schwerwiegenden Nebenwirkungen
einher und birgt die Gefahr zunehmender Resistenzentwicklung. Sogenannte antimikrobielle
Peptide wurden als vielversprechende Kandidaten zur Überwindung dieser entscheidenden
Einschränkungen identifiziert. Im Fokus unserer Arbeit liegen das Peptid NK-2 sowie daraus
abgeleitete Varianten. NK-2 umfasst die kationische Kernregion von NK-Lysin, einem
Immunprotein des Schweins. Im Gegensatz zu Chemotherapeutika wirken solche Peptide
primär durch eine direkte physikalische Zerstörung der Zellmembran. Die zugrundeliegenden
Mechanismen eines selektiven Targetings sind dabei jedoch noch immer weitgehend unklar.
Ziele:
(i) Identifizierung molekularer Zielstrukturen auf humanen Krebszellen, sowie
(ii)
Optimierung der Peptide (Anti-Krebswirkung, Selektivität und
Stabilität).
Methoden: Einer rational basierten Strategie folgend wurden insgesamt 30 Varianten des
Mutterpeptids NK-2 durch Austausch oder Deletion einzelner Aminosäuren synthetisiert.
Modifikationen führten zu Veränderungen der physikochemischen Peptideigenschaften wie
Ladung, Hydrophobizität oder Amphipathizität. Die biologische Aktivität der Peptide wurde
gegen laborübliche Krebszelllinien aber insbesondere auch gegen Darmkrebszellen aus
Patienten evaluiert. Biologische Daten wurden mit Untersuchungen an Modellmembransystemen (Liposomen) korreliert. Die Vorteile der Modellmembranen liegen in einer klar
definierten und frei wählbaren Lipidzusammensetzung und der Zugänglichkeit für eine
Vielzahl
von
biophysikalischen
Untersuchungsmethoden
wie
Zeta-Potential,
Tryptophanfluoreszenz- und FRET-Spektroskopie. Aus der Kombination ergeben sich
mechanistische Hinweise auf Lipidspezifität der Bindung, Interkalation und Permeabilisierung
der Membran durch die Peptide. Dies wiederum ermöglicht einen rationalen Zugang zur
Optimierung der Peptide.
Ergebnisse: Die Anti-Krebszellaktivität der Peptide ist abhängig vom Zelltyp und Medium.
Krebszelllinien erwiesen sich dabei zumeist als widerstandsfähiger als Patientenkrebszellen.
Trotzdem konnte durch Aminosäurevariation die Aktivität der Leitstruktur um das 20-fache
gesteigert werden, während die (unerwünschte) Hämolyse auf praktisch unverändert
niedrigem Niveau verblieb. Das beste Peptid ist auch im Mausmodell aktiv. Mit Hilfe von
FRET- und Fluoreszenz-Spektroskopie wurden Bindung und Einbau der Peptide in
Modellmembranen und auch in Krebszellmembranen analysiert. Der Einbau verläuft extrem
schnell und ist abhängig von der Anwesenheit und Menge negativer Ladungen in der
Membran, z.B. in Form des negativ geladenen Membranlipids Phosphatidylserin.
Tryptophanfluoreszenz-Messungen von NK-2-Derivaten mit Liposomen legen zudem nahe,
dass der Membraneinbau vom N-Terminus des Peptids ausgeht.
Schlussfolgerungen: Die Aktivität der Leitstruktur NK-2 gegen Prostata- und
Darmkrebszellen wurde, unter Erhalt der Selektivität, durch Aminosäureaustausch deutlich
gesteigert. Die für die Aktivität entscheidende Interkalation der Peptide in die
Zielzellmembran ist von der Präsenz negativer Oberflächenladung abhängig. Die schnelle
Kinetik der Bindung und Permeabilisierung der Zielmembran durch die Peptide ist zentrale
Voraussetzung für die Überwindung bestehender und Verhinderung neuer Resistenzen.
15.40 - 16.20 Uhr
Block V
Vorsitz: Prof. Dr. Friedrich Ueberle
•
Den Kopf gewaschen bekommen - Kontaminationen zwischen Kopf und Schaft von
Hüftendoprothesen
Yves Eicke, TUHH
•
Subzelluläre Calcium-Signale in der Immunologischen Synapse – Funktion von
sekundären Botenstoffe und Calcium-Kanälen
Björn-Philipp Diercks, UKE
•
Validierung des Photobleachings als Methode zur Bestimmung von
Diffusionskoeffzienten in kultiviertem Knorpel
Alan Bajat, TUHH
DEN KOPF GEWASCHEN BEKOMMEN - KONTAMINATIONEN
ZWISCHEN KOPF UND SCHAFT VON HÜFTENDOPROTHESEN
Yves Eicke (1), Henning Haschke (1), Nick Bishop (1,2), Florian Witt (1),
M Morlock (1)
Michael
1. Institut für Biomechanik, Technische Universität Hamburg-Harburg
2. Fakultät Life Sciences, Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg
Ziel
Der künstliche Ersatz des Hüftgelenks stellt eine der größten Erfolgsgeschichten der
modernen Medizin dar. Jedoch wird Abrieb und Korrosion zwischen Prothesenkopf und schaft mit dem Versagen von modularen Hüftendoprothesen in Verbindung gebracht [1-2]. In
vivo Messungen in künstlichen Gelenken zeigen hohe Reibmomente, die
Relativbewegungen zwischen den Komponenten begünstigen können [3]. Bei der
Implantation von Prothesen kann es, im Falle einer unzureichenden Reinigung von Kopf und
Schaft, zu einer Kontamination der Konusverbindung kommen (z.B. Knochensplitter, Blut
oder Fettgewebe). Ziel dieser Arbeit ist die Bestimmung des Einflusses von Kontaminationen
in der Konusverbindung auf das Setzverhalten in Abhängigkeit von der Fügekraft mittels
einer neuen Methode zur Simulation von Reibmomenten auf Hüftendoprothesen.
Methoden
Die Prothesenköpfe (CoCr29Mo, M-SPEC, 36mm, +1,5mm; n=5) wurden auf Schäfte
(Ti6Al4V, Corail 12/14, beides DePuy Synthes; n=5) mit einer quasistatischen axialen
Fügekraft gefügt (F=0,5kN, 1kN, 2kN; Z010, ZWICK GmbH). Auf den Köpfen wurde eine
Ebene erodiert, welche eine wechselnde Belastung zur Simulation eines Gangzyklus
ermöglicht. Die Prothese wurde über 20 Gangzyklen belastet, wobei ein simulierter
Gangzyklus aus zwei Phasen besteht (Phase 1: F=1971N; M x =4,85Nm; M y =1,88Nm;
M z =1,04Nm; Phase 2: F=807N; M x =-3,73Nm; M y =1,85Nm; M z =-1,47Nm). Mit Hilfe einer
Koordinatenmessmaschine (Mitutoyo, BHN 305) wurde die Kopfposition nach dem Fügen
und nach den Belastungsschritten in allen sechs Freiheitsgraden ermittelt, woraus die
Relativbewegungen zwischen den Belastungsschritten wurden. Die Abzugskraft, als ein
möglicher Indikator für die Güte der Konusverbindung, wurde nach dem letzten
Belastungsschritt gemessen. Die Kontamination wurde mittels Knochensplitter (1,7±0,2mg)
auf der proximalen Oberfläche der Schäfte simuliert und mit sauberen Prothesen verglichen.
Ergebnisse
Für kontaminierte Prothesen zeigten sich in allen Richtungen, unabhängig von der Fügekraft
signifikant erhöhte Setzstrecken gegenüber einer sauberen Verbindung (p<0,001). Mit
steigender Fügekraft reduziert sich die Translationen und Rotationen im ersten
Belastungsschritt (z.B: Translation auf Konusachse, erster Zyklus, 500N: 450µm; 2000N:
80µm; p<0,001). Die Abzugskräfte (F=890±99N) zeigten keine Abhängigkeit von der
Fügekraft (p=0,303) oder der Kontaminationen (p=0,192).
Schlussfolgerung
Die Studie zeigt, dass selbst kleinste Kontaminationen im Protheseninterface einen Einfluss
auf das initiale Setzverhalten haben können, wodurch eine Korrosion in vivo begünstigt
werden kann. In einem gewissen Rahmen kann dies durch eine ausreichend hohe Fügekraft
durch den Operateur ausgeglichen werden, die mindestens der maximalen Gelenkkraft
entsprechen sollte. Reinigungs- und Fügevorschriften für den Einbau von Hüftendoprothesen
können initial erhöhte Setzstrecken an Prothesenkomponenten verhindern und damit das
Risiko für eine Revisionsoperation mindern.
Quellen
[1] Langton et al, Bone Joint Res: 1(4), 56-63, 2012; [2] Baxmann et al, Med Eng Phys: 35(5), 676-83,
2013; [3] Bergmann et al, Journal of Biomechanics, 34(7), 859-871,2001
M.Sc. Björn-Philipp Diercks (Dissertation)
Institut für Biochemie und Molekulare Zellbiologie
Betreuer: Prof. Dr. Dr. Andreas Guse
Dr. Insa Wolf
ARBEITSTITEL:
„Subzelluläre Calcium-Signale in der Immunologischen Synapse – Funktion
von sekundären Botenstoffe und Calcium-Kanälen“
EINLEITUNG:
Calcium (Ca2+) ist ein universeller Botenstoff im menschlichen Körper, welcher
unterschiedlichste zelluläre Prozesse, wie die Muskelkontraktion, das Zellwachstum, die
Hormonsekretion und neuronale Signalübertragung kontrolliert. Zudem ist Ca2+ essentiell für
die Aktivierung von T-Lymphozyten und somit für die Mobilisierung des adaptiven
Immunsystems. Das hierfür benötigte Ca2+ wird aus intrazellulären Speichern (z.B. dem
Endoplasmatischen Retikulum) freigesetzt und gelangt über Kanäle in der Plasmamembran
aus dem Extrazellularraum in das Zytosol. Ca2+ mobilisierende sekundäre Botenstoffe sind
unter anderem Nicotinsäureadenindinukleotidphosphat (NAADP), D-myo-inositol 1,4,5trisphosphate (IP3) und zyklische ADP-ribose. NAADP ist der stärkste, endogene, Ca2+
freisetzende sekundäre Botenstoff und vermittelt die initiale Freisetzung von Ca2+, welche
nachfolgend durch andere sekundäre Botenstoffe und Ca2+ vermittelter Ca2+-Freisetzung
verstärkt wird. Die NAADP-Rezeptoren werden noch kontrovers diskutiert, zu den
potentiellen Ionen-Kanälen zählen die Ryanodin-Rezeptoren (RYRs) sowie die Two-Pore
Kanäle (TPCs) und der Transient Rezeptor Potential Kanal, Subtyp Mucolipin (TRP-ML1).
ZIEL:
Das Hauptziel meiner Doktorarbeit ist die Aufklärung der Entstehung subzellulärer Ca2+Signale in T-Lymphozyten. Hierfür werden diese Signale nach einer gerichteten Stimulation
von T-Lymphozyten durch Antikörper-gekoppelte Beads untersucht. Insbesondere der
Einfluss von NAADP und RYR auf die initialen Ca2+-Signale und die räumlich-zeitliche
Ausbreitung der Ca2+-Signale werden in RYR-defizienten Jurkat T-Lymphozyten und
primären Maus RYR1-/- T-Lymphozyten analysiert.
METHODEN:
Es wurde eine hochauflösende Life-Cell-Imaging Methode entwickelt, um frühe, lokale Ca2+Signale und deren Ausbreitung in T-Lymphozyten zu detektieren. Hierfür wurden die TLymphozyten mit zwei verschiedenen Farbstoffen (Fluo4 und FuraRed) beladen. Durch die
Kombination dieser Farbstoffe konnte eine Aufnahmegeschwindigkeit von ca. 40 Bilder/sec
erreicht werden. Zusätzlich wurden die T-Lymphozyten mit Antikörper-gekoppelten Beads
(anti-CD3 bzw. anti-CD3/CD28) stimuliert, um eine gerichtete Aktivierung, ähnlich einer
Immunsynapse, zu erreichen.
ERGEBNISSE:
In den ersten Sekunden nach einer gerichteten Aktivierung von Jurkat T-Lymphozyten oder
primären Maus T-Lymphozyten, durch anti-CD3 bzw. anti-CD3/CD28-gekoppelte Beads,
konnten Ca2+-Signale von 79±4 nM bzw. 193±8 nM detektiert werden. Diese initialen Ca2+
Signale liegen dicht an der Aktivierungsstelle und besitzen einen Durchmesser nahe der
unteren räumlichen Auflösungsgrenze (0,43 µm in Jurkat T-Lymphozyten). In den RYRdefizienten Jurkat Zellen sowie den primären Maus RYR1-/- T-Lymphozyten sind diese
initialen Ca2+-Signale entweder nicht detektierbar oder aber die Anzahl der Ca2+-Signale ist
stark reduziert. Des Weiteren kommt es zu einer signifikanten Verringerung in den
Amplituden der Ca2+-Signale bei den RyR-defizienten Jurkat sowie den primären RYR1-/Zellen.
SCHLUSSFOLGRUNG:
Die hier entwickelte, hochauflösende Mikroskopiemethode ermöglicht es zum ersten Mal, die
initialen Ca2+-Signale in T-Lymphozyten zu charakterisieren. Die RYR spielen eine
entscheidende Rolle in der ersten Phase der Aktivierung von T-Lymphozyten, wodurch die
Bedeutung der RYR als potentielle NAADP-Rezeptoren verstärkt wird.
Poster
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Parmeshwar Narayan
Deniz
Kerstin
Joanna
Lena
Alisa
Maksymilian
Jorge
Philipp
Kilian
Rebecca
Ellen
Lorenz
Johannes
Mandy
Tobias
Hanna
Benjamin
Malte Erik
Fabian
Jan
Janko
Sharma -HAW
Lehnert -HAW
Rudnik -TUHH
Fafinska -Uni HH
Morschheuser -Uni HH
Gruschka -Uni HH (ZMNH)
Prondzynski -UKE
Duque Escobar -UKE
Koch -UKE
Stockhausen -UKE
Halbach -Uni HH
Gattkowski -Uni HH
Ulsamer -Uni HH
Möller -TUHH
Körner -TUHH
Konow -TUHH
Messing -TUHH
Hollmach -TUHH
Schröder -TUHH
Freiberger -TUHH
Demmer -HAW
Lucks -HAW
Thema
Studierende
Fachgebiet
Betreuer
Art der Arbeit
New Dengue Antigens: Expression of Dengue envelope domains 1 and 2
Deniz Lehnert, Biotechnologie, HAW Hamburg
Virologie
Dr. Michael Schreiber, Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin
Bachelor-Thesis
Introduction: The Dengue virus E protein is formed by three domains, ED1, ED2 and ED3
(Fig. 1 A). ED3 can easily be cloned and expressed as a recombinant protein since it is
coded by a single gene segment. In contrast, ED1 and ED2 sequences are organized
differentially. The ED1 coding sequence is divided into three segments, and two gene
segments encoding for the ED2 domain (Fig. 1 B). Thus, recombinant forms of ED1 and ED2
are not available as diagnostic tools.
Objectives: ED1 and ED2 domains will be expressed combining the coding sequences by
linking them with amino acids forming a turn motif, e.g. Gly-Pro-Gly. The design of the linker
region will be based on existing structural data.
Methods: All expression constructs were clones using the Gibson assembly technology into
the pMAL-p4X E. coli vector. Using pMAL-p4X, the ED1 or ED2 coding sequence is fused to
the maltose binding protein (MBP), allowing easy protein purification. ED1 and ED2 fusion
proteins were tested for antibody reactivity using DENV-sera.
Results: ED1 and ED2 were successfully expressed for each serotype due to a Gly-Pro-Gly
linker sequence. Fusion proteins representing ED1 and ED2 from DENV-2 and DENV-4
reacted with DENV-positive sera in contrast to the DENV-1 and DENV-3 constructs. Based
on these results we have constructed ED1 and ED2 proteins with various linker regions.
Conclusion: The strategy to combine the different gene segments of ED1 and ED2 by
amino acids, which form a turn motif, allows the generation of recombinant proteins which
represent the respective single E protein domain. These antigens could be used to study the
structure and the antibody responses to each of the separated domains, ED1, ED2 and ED3.
Fig. 2
E Protein gene organization ED1 (red), ED2 (Yellow), ED3 (blue)
Selektion von DNA-Aptameren zur gezielten Inhibition der Metastasierung
Autorin: Joanna Fafinska; Betreuer: Prof. Dr. U. Hahn und Dr. Rassa Faryammanesh
1. Einleitung
Ziel des Projektes ist die Selektion von DNA-Aptameren für zwei Oberflächenproteine mit
Hilfe des Zell-SELEX-Prozesses (Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle
Anreicherung). Durch gezielte Adressierung von Zelloberflächenproteinen mittels Aptameren
sollen Adhäsionsproteine maskiert werden, die eine entscheidende Rolle bei der
Metastasierung spielen. Bei Aptameren handelt es sich um kurze Nucleinsäuren, die
aufgrund ihrer räumlichen Faltung hoch affin und spezifisch an ihre Targetmoleküle binden,
sie wirken im Prinzip wie Antikörper. Zielmoleküle bei diesem Projekt sind die
Oberflächenproteine CD24 und CD54 (cluster of differentiation), die bei vielen malignen
Krebszellen im Vergleich zu Zellen des gesunden Gewebes ein erhöhtes Expressionsmuster
aufweisen. Sie dienen der intrazellulären Kommunikation, da sie neben Signal- und
Rezeptorfunktionen auch enzymatische Eigenschaften aufweisen. Eine gezielte Inhibierung
der Moleküle ist von besonderem therapeutischen Interesse, um die Ausbreitung bösartiger
Tumore zu verhindern. Zusätzlich könnten die selektierten Aptamere auch als Tumormarker
oder als Bestandteil von Tumorimpstoffen eingesetzt werden.
2. Methoden
Im Rahmen der Doktorarbeit sollen targetspezifische Aptamere mittels Zell-SELEX ausfindig
gemacht werden. Bei dieser Abwandlung der SELEX-Methode wird die native Faltung der
Proteine gewährleistet, da sie direkt von Zellen präsentiert werden. Somit wird eine höhere
Effizienz des SELEX-Prozesses erreicht. Der Erfolg des Prozesses wird hauptsächlich mit
Hilfe der Durchflusszytometrie überprüft, um die Affinität der Nucleinsäuren zu den
Krebszellen direkt zu analysieren. Als Kontrolle dienen Knock-down-Zellen, bei denen gezielt
die Expression eines der Targetmoleküle durch shRNA unterdrückt wurde. So lässt sich
schnell eine Aussage über die Bindung und Spezifität des Nucleinsäure-Pools treffen und
eine anschließende Identifizierung einzelner Aptamere wird möglich.
3. Ergebnisse
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass mittels Zell-SELEX eine Anreicherung von
bindenden Nucleinsäuren an die Zielzellen im Vergleich zu den Knock-down-Zellen erreicht
werden konnte. Da jedoch auch bei den Knock-down-Zellen eine schwache Anreicherung
der Nucleinsäuren zu beobachten ist, muss davon ausgegangen werden, dass durch die
Selektion Aptamere für verschiedene Zelloberflächenproteine selektiert worden sind, welche
sich auch auf den CD54/CD24-Knock-down-Zellen befinden.
4. Schlussfolgerung
Da Zellen zahlreiche Oberflächenproteine präsentieren, führt die Selektion mittels ZellSELEX zu Aptameren mit unterschiedlicher Affinität und Spezifität. Um dies zu umgehen
wird in Zukunft eine Kombination aus konventioneller SELEX und Zell-SELEX durchgeführt.
Analyse von phosphorylierten Peptiden mittels HPTLC –
Neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Signaltransduktionskaskaden
Lena Morschheusera, Sandra Mükuschb, Maria Truschc, Harald Seitzb, Sascha Rohna
a
Institut für Lebensmittelchemie, HAMBURG SCHOOL OF FOOD SCIENCE, Universität
Hamburg, Grindelallee 117, 20146 Hamburg
b
Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie, Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse,
Am Mühlenberg 13, 14476 Potsdam
c
Institut für Organische Chemie, Universität Hamburg, Grindelallee 117, 20146 Hamburg
Während die traditionelle Proteomanalytik etwa zehn Jahre lang versuchte, die Gesamtheit
der Proteine zu kartographieren, geht der Trend inzwischen wieder in Richtung der
detaillierten Analytik einzelner, intakter Proteine. Speziell die Identifikation von Proteinen mit
unterschiedlichen posttranslationalen Modifikationen (PTM), deren Gesamtheit mittlerweile
als Proteoform bezeichnet, rückt dabei in den Vordergrund. Gerade in Hinblick auf die
weitere Erforschung von Signaltransduktionswegen ist es wichtig, das Auftreten
phosphorylierter Peptide/Proteine zu untersuchen, um auf die intrazelluläre Kommunikation
rückschließen zu können. Die konventionell durchgeführte massenspektrometrische Analytik
phosphorylierter Peptide bzw. Proteine bedarf jedoch zumeist aufwendiger Reinigungs- und
Aufarbeitungsschritte.
Im Vordergrund dieser Arbeiten stand die Entwicklung einer Methode zur schnellen
Reaktionskontrolle, basierend auf Modellpeptiden, die an der nozizeptive Transduktion
beteiligt sind. Es sollte dabei ausschließlich das Auftreten einer Phosphorylierung, nicht aber
deren genaue Position anhand eines schnellen Nachweises bestimmt werden. Aufgrund der
vielfältigen Vorteile einer dünnschichtchromatographischen Trennung, wie beispielsweise der
hohe Probendurchsatz sowie das leichte clean-up der Proben, wurde auf die Analyse mittels
Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) zurückgegriffen. Diese ist bei der
Analytik
phosphorylierter
Peptide
besonders
zielführend,
da
aufwendige
Probenaufarbeitungen vermieden werden können. Neben massenspektrometrischer
Kopplungsverfahren bietet die HPTLC eine Vielzahl weiterer Detektionsmöglichkeiten
(verschiedene Derivatisierungen mit Farbreagenzien, effect directed analysis (EDA) mittels
Antikörpern oder Aptameren etc.). Im Rahmen dieser Arbeiten war es das Ziel eine selektive,
immunologische Detektionsmethode zu entwickeln, die es erlaubt zeitgleich in mehreren
Proben phosphorylierte Peptide spezifisch zu visualisieren und für eine parallele,
massenspektrometrische Analyse vorzubereiten.
Zunächst stand die Optimierung der Chromatographiebedingungen im Fokus. Nach
erfolgreicher Festlegung der Parameter war es möglich, einzelne Peptide sowie diverse
Mischungen dünnschichtchromatographisch zu trennen. Diese wurden anhand ihres R f Wertes nachgewiesen. Im Anschluss daran konnten die Peptide mit Hilfe einer Kopplung
zwischen HPTLC und Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation mit Flugzeitanalysator
(HPTLC-MALDI-TOF-MS) identifiziert werden. Parallel konnte eine Detektionsmethode zum
hochspezifischen Nachweis von Phosphopeptiden entwickelt und erfolgreich angewendet
werden.
Phenotypic Characterization and Molecular Therapy in Human
iPSC-derived Cardiac Myocytes
Maksymilian Prondzynski
Universitätsklinikum Eppendorf, Prof. Dr. Lucie Carrier und Dr. Giulia Mearini
The technique of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and their ability to differentiate into
any kind of cell offers an exceptional human disease model. Additionally, patient-derived
iPSC lines can be generated with disease-relevant mutations. This constitutes a brilliant
chance for gaining new insights into pathophysiology and for evaluation of molecular
consequences and therapeutics in genetic diseases, such as hypertrophic cardiomyopathy
(HCM). HCM is an autosomal-dominant disease, characterized by myocardial disarray, left
ventricular hypertrophy and diastolic dysfunction. Molecular links between genetics and
clinical outcome are still elusive and no curative treatment is available up to date. One
therapeutical approach addressing this problem is spliceosome-mediated RNA trans-splicing
(SMaRT). SMaRT is a RNA-based approach, which reduces the level of defective transcripts
in the patient´s cell by repaired full length mRNA. Aim of this study was to evaluate activity
and efficiency of SMaRT in human iPSC-derived cardiac myocytes (iPSC-CMs). For that
purpose two iPSC-derived cell lines were provided: C25, from a healthy donor, used as a
control, and CMS01, from a HCM patient with a disease-causing mutation in the MYBPC3
gene. Both cell lines were morphologically characterized by a high content screening
approach using the Opera® High Content Screening System. Upon analyzing of > 3000
images with the Columbus™ Image Data Management and Analysis System and estimation
of cell characteristic for > 120,000 cardiac myocytes a hypertrophic phenotype was observed
for CMS01, with up to 1.7-fold higher cell areas, 1.3-fold higher cell widths and 1.3-fold
higher cell lengths than C25. In addition, the feasibility of the molecular-based approach
SMaRT was evaluated in C25 iPSC-CMs. SMaRT was successful by 5´- and 3´-transsplicing approaches via engineered pre-trans-splicing molecules (PTMs) with efficiencies of
0.4% and 0.05%, respectively. This master thesis provided for the first time information on
morphological cell characteristics of C25 and CMS01 and additionally showed successful
application of SMaRT in C25 iPSC-CMs. Robust estimation of cellular characteristics in a
high content approach offers great potential for drug discovery to find new ameliorating
compounds for relieving HCM-associated symptoms and SMaRT, as a molecular-based
therapeutic approach, offers a potential disease prevention and treatment for HCM in the
future.
Direkte Regulation der Beta-Zellschädigenden Kinase DLK
durch die Beta-Zellprotektive Phosphatase Calcineurin
J. Duque Escobar1, T. Lemcke2, D. Hasenpusch2, E. Oetjen1,2
1)
Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Hamburg
Eppendorf, Martinistr. 52, 20246 Hamburg, 2) Institut für Pharmazie, Bundesstr. 45, 20146
Hamburg,
Abstract
Einleitung/Ziel
Ein Verlust der Beta-Zellmasse und Beta-Zellfunktion in den Langerhans’schen Inseln des
Pankreas führt zum klinisch apparenten Bild des Diabetes Mellitus Typ 2. Über welche
molekularen Mechanismen diese Beta-Zelldekompensation zustande kommt, wird heute
noch umstritten diskutiert. Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der
Calcium Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin durch Cyclosporin A und
Tacrolimus zu einer verringerten Insulin-Gen-Transkription führt (Oetjen et al.,2003). Beide
Stoffe stimulieren die katalytische Aktivität der Mitogen-Aktivierten Protein Kinase Kinase
Kinase 12 (DLK Dual Leucine Zipper Kinase) und induzieren Beta-Zellapoptosis (Plaumann
et al.,2008).. In diesem Projekt wurde die Regulation der DLK durch Calcineurin untersucht.
Methoden
Klonierung, Transiente Transfektionen in die Beta-Zelllinie HIT, Reportergenassay,
Immunoblot-Analyse, Molekulardynamische Simulationen
Ergebnisse
In silico Analyse ergab zwei putative Calcineurin-Interaktionsdomänen innerhalb der DLK.
Die Konsensussequenzen 273-PNMLIT-278 und 362-LPVP-365 wurden zu PNRLKT, APAP
und einer Doppelmutante mithilfe einer Primerless PCR mutiert. Die Expressionsvektoren
dieser Mutanten und des DLK Wildtyps wurden mittels transienter Transfektionen in die
Beta-Zelllinie HIT (Hamster Insulinoma Tumor) überführt. Immunoblot-Analyse mit einer
Antikörperbehandlung spezifisch gegen das C-terminale DLK-Ende zeigte ähnliche
Expressionsniveaus bei den Einzelmutanten, während die Doppelmutante kaum exprimiert
wurden. Beide Einzelmutanten wiesen keine katalytische Aktivität auf, gemessen an der
Phosphorylierung von DLK an Ser-302 (Autophosphorylierung) und an der Phosphorylierung
von JNK (aktive Phosphorylierung).
Ein neu erstelltes DLK Homologie Model bestätigt, dass PNMLIT mit der Konformation der
katalytischen Domäne interferiert. Die Mutation von L362 zu A und V364 zu A innerhalb der
zweiten putativen Calcineurin-Interaktionsdomäne verringerte nicht die DLK Protein
Expression. Die L362A DLK Mutante zeigte keine katalytische Aktivität, während die V364A
DLK Mutante zu einer 3-Fach erhöhte JNK Phosphorylierung im Vergleich zum DLK Wildtyp
führte. In Reportergenassays zeigte diese Mutante eine effektivere Hemmung der mit
KCl/Forskolin induzierten CRE-abhängigen Transkription als der DLK Wildtyp.
Schlussfolgerung
Angesichts der Bedeutung von Calcineurin für die Aufrechterhaltung der Beta-Zellfunktion
und Beta-Zellmasse und der zuvor gezeigten Beta-zelltoxischen Wirkung der DLK konnten
unsere Ergebnisse zeigen, dass Calcineurin die DLK direkt reguliert. Eine Hemmung der
DLK könnte in der Zukunft eine neue Therapieoption für die Behandlung des Diabetes
Mellitus Typ 2 darstellen.
Über die Bedeutung parietofrontaler
Faserbahnen für die motorische Funktion nach
einem Schlaganfall
Name: Philipp Koch, Student im Fach Humanmedizin
Neurologie, Name Betreuer: Robert Schulz, Friedhelm Hummel
Dissertation
Abstrakt:
Ziel
Cortico-corticale Verbindungen zwischen dem parietalen Cortex und frontalen primär- und
sekundär-motorischen Arealen sind entscheidend beteiligt in der Planung sowie Ausführung
komplexer Handbewegungen. Eine besondere Rolle wird hierbei dem ventralen
Prämotorkortex (PMv) sowie dem anterioren (aIPS) und caudalen (cIPS) Anteil des
intraparietalen Sulcus zugeschrieben. Es bleibt unklar, inwieweit dieses Netzwerk für die
Ausführung simpler motorischer Aufgaben nach einem Schlaganfall an Relevanz gewinnt.
Wir stellen die Hypothese auf, dass die strukturelle Integrität der unterliegenden corticocorticalen Verbindungen dieser Areale mit der Erholung nach einem Schlaganfall in
Beziehung gesetzt werden kann.
Methodik
In die Studie wurden 25 Schlaganfallpatienten im chronischen Stadium der Rehabilitation
eingeschlossen (Alter 64±8.8 Jahre, 46-75 Jahre, 17 männlich, ein Linkshänder). Diese
wurden 34 Monate (12-169 Monate) nach dem Infarktereignis funktionell evaluiert. Mit Hilfe
der Griffkraft, der Zangengriffkraft und dem Fugl-Meyer Wert der oberen Extremität wurde
auf Basis einer Multifaktorenanalyse ein Motorfunktionswert ermittelt, der eine generell
rehabilitative Funktion abbilden soll. Die ausgewählten cortico-corticale Verbindungen des
parietofrontalen motorischen Netzwerkes zwischen dem primären Motorcortex (M1), PMv,
aIPS und cIPS rekonstruierten wir unter Anwendung der Diffusions-Tensor-Bildgebung und
probabilistischer Traktographie in jedem Patienten.
Als Maß der mikrostrukturellen Integrität wurde die Fraktionelle Anisotropie (FA) dieser
Faserbahnen individuell ausgelesen. Innerhalb generalisierter linearer Modelle korrelierten
wir die FA mit der motorischen Funktion und adjustierten für den Einfluss der Integrität des
corticospinalen Traktes dieser Patienten.
Ergebnisse
Die Rekonstruktion zeigt sich gut reproduzierbar in allen 25 Patienten.
Es findet sich ein signifikanter, positiver Einfluss der Integrität der Faserbahnen zwischen
aIPS und PMv (p<0.01) sowie zwischen PMv und M1 (p<0.001) auf die motorische Funktion.
Schlussfolgerung
Mit dieser Analyse können wir erste Daten über strukturelle Konnektivität im parietofrontalen
Netzwerk in chronischen Schlaganfallpatienten präsentieren. Diese sprechen in
Übereinstimmung mit früheren Arbeiten für den besonderen Einfluss nicht nur frontaler
sondern auch parietaler sekundär motorischer Areale im Rahmen der motorischen Erholung
nach einem Schlaganfall.
Analyse der Kollagenfaserorientierung in der humanen Knochenmatrix bei muskuloskelettalen Erkrankungen
Kilian Stockhausen, M.Sc., Institut für Osteologie und Biomechanik, Universitätsklinikum
Hamburg-Eppendorf
Ziel: Mehr als 1.7 Milliarden Menschen sind weltweit von muskulo-skelettalen Erkrankungen
(z.B. Osteoporose, Morbus Paget, Osteogenesis Impefecta, Arthritis,) betroffen: Die
Prognose für die nächsten Jahre ist steigend. Statistisch erleiden ca. 30% aller Frauen, und
ca. 20% aller Männer über 50 Jahre eine Osteoporose-bedingte Fraktur, was einen
erheblichen Einfluss sowohl auf die Lebensqualität der Betroffenen als auch auf das
Gesundheitssystem und die Wirtschaft hat. Frakturen werden durch verschiedene Parameter
begünstigt, die unter dem Begriff Knochenqualität zusammengefasst sind. Dazu gehören die
Knochenmasse, Mikroarchitektur, kumulierte mikroskopische Frakturen, Rate der
Knochengeweberemodellierung des Knochens sowie die Menge, Qualität und Ausrichtung
von mineralischen Kristalliten und Kollagenfasern. Während die anderen Faktoren auf das
Frakturrisiko extensiv erforscht werden, ist der Einfluss von Kollagen noch nicht ausreichend
untersucht. Kollagen ist ein wesentlicher Bestandteil der organischen Matrix des Binde- und
Stützgewebes und im Knochen essentiell für die Belastbarkeit und Elastizität. Im Osteon, der
funktionellen Grundeinheit des Knochens, laufen die kollagenen Lamellen konzentrisch um
den Havers-Kanal. Die Ausrichtung der Fasern in den Lamellen kann je nach Skelettregion
und Belastung variieren. Sind die Kollagenfasern senkrecht zur Längsachse des Knochens
ausgerichtet, kann Kompressionskräften effektiver entgegen gewirkt werden. Zugkräften wird
besser standgehalten, wenn sie parallel zur Längsachse liegen. Dies führt zu der Hypothese,
dass eine veränderte Orientierung der Kollagenfasern einen starken Einfluss auf die
Belastbarkeit des Knochens hat. In diesem Projekt soll die Orientierung der Kollagenfasern
in der humanen Knochenmatrix bei muskulo-skelettalen Erkrankungen quantitativ untersucht
werden. Damit soll das Frakturverhalten genauer prognostiziert und Erkrankungen besser
therapiert werden können.
Methode: Die Proben werden in einer Kooperation mit dem Institut für Rechtsmedizin (Prof.
Dr. med. K. Püschel) von männlichen und weiblichen Körperspendern zwischen 10 und 90
Jahren aus dem Femur und Beckenkamm entnommen. Außerdem kann auf eine große
Anzahl von Proben, aller Altersstufen und beider Geschlechter, aus dem Archiv des Instituts
für Osteologie und Biomechanik zurückgegriffen werden. Für die Analyse wird ein
Polarisationsmikroskop mit einem Zirkularpolarisator verwendet. Teile der Knochenmatrix
weisen eine charakteristische Doppelbrechung auf, die stark von der Existenz und
Orientierung der Kollagenfasern im Knochen geprägt ist. Polarisationsmikroskopie kann dazu
benutzt werden, die Doppelbrechung der Kollagenfasern im Knochen zu quantifizieren und
so die Orientierung der Kollagenfasern zu bestimmen. Weiterhin wird Second Harmonic
Generation Imaging genutzt, das eine Validierung der Kollagenfasern in 3D erlaubt. Diese
Technik basiert auf einem nicht-linearen optischen Effekt, bei dem zwei Photonen eines
hochenergetischen Lasers in Kollagen interagieren und ein leicht detektierbares Photon mit
doppelter Frequenz erzeugt wird. Komplementär dazu wird mittels quantitativer
Rückstreuelektronenmikroskopie der Mineralisierungszustand der Osteone ermittelt, um den
Zusammenhang mit der Kollagenausrichtung zu untersuchen. Mikroindentations-Prüfungen
geben Aufschluss über die mechanische Kompetenz des Knochens.
(Vorläufige) Ergebnisse: Es wurde herausgefunden, dass die Kollagenorientierung im
Oberschenkelknochenschaft (Corpus ossis femoris) in der Transversalebene stark variiert. In
Abhängigkeit von der externen mechanischen Belastung die der Femur erfährt (u.a.
Kompression und Tension), sind die Kollagenfasern so ausgerichtet den entsprechenden
Kräften optimiert entgegenwirken zu können. Dorsal und ventral in der Medialebene ist die
Ausrichtung der Fasern parallel zur Längsachse des Knochens, während lateral eine
orthogonale Kollagenausrichtung dominiert. Im Beckenkamm sind deutliche Unterschiede in
der Orientierung dorsal und ventral zu beobachten. Morbus Paget Proben weisen die
charakteristische ungeordnete Knochenstruktur auf, bedingt durch eine erhöhte Rate der
Knochengeweberemodellierung, die die mechanische Kompetenz (z.B. E-Modul und Härte)
einschränkt. Unabhängig von der Orientierung des Kollagens scheinen die Osteozyten,
mechanosensitive Zellen im Osteon, zwischen den einzelnen Lamellen zu liegen. In
Übereinstimmung mit dem aktuellen Stand der Forschung scheint die Zementlinie Kollagendefizient, was eine Analyse mit Polarisationsmikroskopie erschwert.
Ausblick: Im Hinblick auf die potentiell veränderte Orientierung der Kollagenfasern in
Osteopathien sollen weitere Parameter auf osteonaler Ebene geprüft werden: wie verhält
sich die Kollagenorientierung abhängig vom Mineralisationsgrad des Knochens? Von
besonderem Interesse dabei ist: Weibliche Personen im fortgeschrittenen Alter sind
besonders anfällig für Knochenfrakturen. Haben Alter und Geschlecht Einfluss auf die
Qualität der Kollagenfasern? Außerdem soll die Kollagenausrichtung bei Morbus Paget,
Osteogenesis Imperfecta und Osteoporose im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe
quantitativ untersucht werden.
Molekulare Relevanz von MED15 in Hals- KopfPlattenepithelkarzinomen
Rebecca Halbach 1)
1)
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Einleitung
Plattenepithelkarzinome des Hals-Kopf-Bereichs (HNSCC) gehören zu den sechst
häufigsten Tumorerkrankungen weltweit. Die Mortalität ist trotz Fortschritten in den
Behandlungsmöglichkeiten seit Jahrzehnten unverändert und liegt bei etwa 50%. Hals-KopfKarzinome weisen häufig einen veränderten Smad-abhängigen TGFβ-Signalweg auf und
Hals-Kopf-Tumore mit aktivem TGFβ-Signalweg sind mit höherer Malignität assoziiert.
Der Mediator-Komplex ist ein hoch konservierter Transkriptions-Coaktivator für die
Expression protein-kodierender Gene in Eukaryoten. Er dient als Bindeglied zwischen der
RNA Polymerase II und dem basalen Transkriptionsapparat auf der einen Seite und diversen
Transkriptionsfaktoren auf der anderen Seite. Die Untereinheit MED15 interagiert mit
Smad2/3-Smad4 im TGFβ-Signalweg, um die Transkription von TGFβ-Zielgenen zu
ermöglichen. Vorarbeiten im Labor haben anhand der Bonner Patientenkohorte gezeigt, dass
in HNSCC-Gewebe MED15 häufig überexprimiert ist und ebenfalls mit schlechteren
klinischen Erfolgen und höheren Sterblichkeitsraten korreliert. Außerdem wurde eine
Assoziation zwischen einer MED15 Überexpression und aktivem TGFβ-Signalweg sowie mit
erhöhter Expression des Proliferationsmarkers Ki67 in Patientengewebe gefunden.
Mittels funktionellen Experimenten sollte die Relevanz von MED15 auf molekularer Ebene
untersucht und die immunhistochemischen Daten von Karzinompatienten bestätigt werden.
Methoden
Expression und zelluläre Lokalisation von MED15 wurden in zwei HNSCC-Tumorzelllinien
mittels Western Blot und Immunofluoreszenz ermittelt. Um den Einfluss von TGFβ auf die
MED15 Expression zu untersuchen, wurden Zellen mit rekombinantem TGFβ behandelt und
die MED15-Proteinexpression zeitabhängig im Western Blot im Vergleich zu unbehandelten
Zellen dargestellt. Zur Untersuchung des Einflusses von MED15 auf Proliferation und
Migration wurde mit MED15-spezifischer siRNA die Genexpression in HNSCCTumorzelllinien transient vermindert. Anschließend wurde durch MTT-Proliferationsassays
sowie immuncytochemischer Analyse des Proliferationsmarkers Ki67 die Proliferation von
knockdown-Zellen gemessen. Zusätzlich wurde durch Scratch-Assays die Migration von
knockdown-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen untersucht.
Ergebnisse
Hyperaktivierung des TGFβ -Signalweges führt zu einer verstärkten Expression von MED15.
Reduktion der MED15-Expression durch siRNA-vermittelten knockdown reduziert die
Zellproliferation im MTT-Proliferationsassay und führt zu verminderter Expression des
Proliferationsmarkers Ki67 im Vergleich zu Kontrollzellen. Außerdem zeigen knockdownZellen verminderte migrative Fähigkeiten, eine Eigenschaft, die Grundlage für die
Metastasierung von Tumoren bildet.
Fazit
Verminderte Proliferation und Migration von knockdown-Zellen, zeigen die Relevanz von
MED15 in Hals-Kopf-Tumoren. Die erhöhte Expression von MED15 nach Hyperaktivierung
legt nahe, dass MED15 durch den TGFβ Signalweg im Sinne einer Positivregulation
moduliert wird, da verstärkt aktiver Signalweg höhere MED15-Level erfordert. Insgesamt
weisen die experimentellen und klinischen Daten darauf, dass MED15 Tumorzellen
Wachstums- und Überlebensvorteile bietet und daher mit erhöhter Mortalität assoziiert ist.
MED15 könnte daher auch ein interessantes neues Target in der Tumortherapie darstellen.
Analyse subzellulärer Calciumsignale in T-Lymphozyten
Bachelorarbeit von Ellen Gattkowski, Universität Hamburg
Einleitung und Ziel
Ca2+ vermittelte Signalwege spielen bei der Aktivierung und Re-Aktivierung von TLymphozyten eine zentrale Rolle. Nach Aktivierung des T-Zell-Rezeptors erfolgt die Bildung
verschiedener second messenger, welche die Ausschüttung von Ca2+ aus intrazellulären
Speichern sowie den Ca2+ Einstrom über die Plasmamembran bewirken. Durch die
Veränderung der Ca2+-Konzentration wird neben anderen Prozessen die Proliferation der TZellen als Voraussetzung für eine funktionelle adaptive Immunantwort eingeleitet.
Der second messenger Nikotinsäureadenindinukleotidphosphat (NAADP) vermittelt die Ca2+Freisetzung besonders effektiv und wirkt in der initialen Phase des Ca2+-Signalings. Der
Rezeptor, an den NAADP bindet und damit verbunden das Zellkompartiment, aus welchem
Ca2+ freisetzt wird, wird noch erforscht. Dabei werden zwei Modellvorstellungen der NAADPvermittelten Ca2+-Freisetzung diskutiert. Das Two-pool Modell geht davon aus, dass NAADP
zunächst eine geringe Ca2+-Menge durch Öffnung der lysosomalen Two-pore channels 1 und
2 freisetzt. Das Ca2+-Signal wird anschließend durch Aktivierung des Ryanodinrezeptors
(RyR), der Ca2+ aus dem ER freisetzt, amplifiziert. NAADP könnte aber auch direkt an den
RyR 1 binden und Ca2+ ausschließlich aus dem ER freisetzen. In Jurkat-T-Lymphozyten
wurden zudem Hinweise darauf gefunden, dass die NAADP-Bindung über Bindeproteine
vermittelt und im Komplex die Kanalöffnung der RyR erzielt wird.
Ziel der Arbeit war die Analyse und Charakterisierung initialer, lokaler Ca2+-Signale von
NAADP in RyR-defizienten Jurkat-T-Zellen verglichen mit denen in Kontrollzellen. Der
Einsatz eines neuen hochauflösenden Ca2+-Life-Cell-Imagingsystems sollte Hinweise auf die
Differenzierung zwischen den postulierten Modellen der NAADP-vermittelten Ca2+Freisetzungen ermöglichen.
Methoden
Die Analyse des Ca2+-Signalings wurde in einem RyR-knockdown-Klon und einem
Kontrollklon der T-Lymphozyten Zelllinie Jurkat durchgeführt. Dazu wurden die T-Zellen mit
den Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen Fluo-4 und Fura Red beladen. Die Änderung der
intrazellulären Ca2+-Konzentration wurde mittels hochauflösendem Ca2+-Life-Cell-Imaging
nach Mikroinjektion von NAADP, bzw. IP 3 (Positivkontrolle im knockdown Klon) und
Intrazellulärpuffer (Negativkontrolle), ratiometrisch untersucht. Das neue Imaging-System
ermöglicht mit 48 Bildern/Sekunde eine achtfach gesteigerte Aufnahmerate im Vergleich zu
früheren Analysen.
Ergebnisse
Mit der neuen Life-Cell-Imaging-Methode konnte zum ersten Mal Ca2+-Signale
hochauflösend untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass die Ausbreitung des Ca2+-Signals
im Kontrollklon nach NAADP-Mikroinjektion in Form einer vom Injektionspunkt ausgehenden,
über die Zelle laufenden Ca2+-Welle verläuft. Dabei konnte in den Kontrollzellen zwischen
zwei Mustern der Ca2+-Signalausbreitung unterschieden werden. Die Charakterisierung der
initialen, lokalen Ca2+-Signale, die bereits 20 ms nach der Injektion erfasst wurden, erfolgte
hinsichtlich ihrer Größe, Amplitude und Anzahl.
Im Gegensatz dazu konnten in dem RyR-knockdown Klon weder lokale noch globale
NAADP-vermittelte Ca2+-Signale erfasst werden, was auf die Bedeutung des Rezeptors
hinweist.
Schlussfolgerung
Die in dieser Arbeit erhobenen Daten weisen darauf hin, dass RyR eine wesentliche Rolle für
die NAADP-hervorgerufenen Ca2+-Signale in T-Lymphozyten spielen. Bei verminderter
Expression des RyR können zu einem sehr frühen Zeitpunkt von 20 ms nach der Applikation
von NAADP keine lokalen Signale beobachtet werden, so dass eine direkte Aktivierung des
Rezeptors durch NAADP wahrscheinlich ist.
Untersuchung der osteoanabolen Funktion des Signalmoleküls Wnt1
Die Knochenmatrix wird auch im Erwachsenen ständig umgebaut, was durch die koordinierte
Aktivität Knochen-bildender Osteoblasten und Knochen-resorbierender Osteoklasten
vermittelt wird. Ist das Gleichgewicht beider Zelltypen zugunsten der Osteoklasten
verschoben, kommt es zu Knochenmasseverlustsyndromen, z.B. Osteoporose. Während
bislang etablierte Therapie-Optionen zur Behandlung dieser Erkrankungen auf einer
Hemmung der Knochen-Resorption beruhen, ist das primäre Ziel der Grundlagenforschung
im Bereich des Knochens Therapie-Optionen zu entwickeln, die durch Stimulation der
Osteoblasten die Knochenbildung fördern.
Vor diesem Hintergrund war die Entdeckung von großer Bedeutung, dass inaktivierende
Mutationen des Wnt-Co-Rezeptors Lrp5 im Menschen zu Osteoporose führen, während
aktivierende Lrp5-Mutationen eine gesteigerte Knochenbildung bedingen. Diese
Erkenntnisse der Humangenetik ließen drauf schließen, dass die durch Liganden der WntFamilie aktivierte Signaltransduktion ein wichtiger Mechanismus ist, um die OsteoblastenAktivität zu regulieren. Genau deshalb war eine weitere wichtige Beobachtung, dass
inaktivierende Mutationen von Wnt1, einem der 19 bekannten Wnt-Gene, im Menschen zu
einer schweren Beeinträchtigung der Knochenbildung führen.
Um die Rolle von Wnt1 im Knochenmetabolismus besser zu verstehen, soll in der
vorliegenden Dissertation ein Mausmodell mit induzierbarer Wnt1-Expression auf
histologischer, zellulärer und molekularer Ebene analysiert werden. Dieses Modell beruht auf
dem sogenannten TetOff-System, mit dem durch Gabe von Doxycyclin eine TransgenExpression verhindert werden kann. Die zu analysierenden Mäuse enthalten im vorliegenden
Fall sowohl ein Transgen zur Osteoblasten-spezifischen Expression des durch Doxycyclin
inaktivierten Tetrazyklin-Respressors, als auch ein Transgen, in dem die kodierende Wnt1Sequenz unter der Kontrolle eines Tetrazyklin-responsiven Elements steht. Nach Absetzung
von Doxycyclin und somit aktivierter Wnt1-Expression sollte im Anschluss der
Knochenphänotyp dieser Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten histomorphometrisch
analysiert werden.
In dieser Untersuchung zeigte sich bislang, dass bereits nach einer Woche der Induktion ein
deutlich osteoanaboler Effekt von Wnt1 nachweisbar war. Nach 3 bzw. 9 Wochen war die
trabekuläre Knochendichte im Vergleich zu Kontrolltieren bereits mehr als 5-fach erhöht.
Durch zelluläre und dynamische Histomorphometrie konnte zudem nachgewiesen werden,
dass die Wnt1-Induktion nicht die Anzahl der Osteoklasten reduzierte, sondern vielmehr die
der Osteoblasten erhöhte, welche auch eine erhöhte Aktivität aufwiesen. In aus
Schädeldächern isolierten primären Osteoblasten dieser Mäuse wurde zudem eine stark
erhöhte Wnt1-Expression auf mRNA-Ebene diagnostiziert, es fehlt jedoch noch ein
Nachweis des sezernierten Proteins im Medium der kultivierten Zellen. Diese Zellkulturen
sollen nun weiterführend analysiert werden, da sie es ermöglichen, den Effekt von Wnt1 auf
molekularer Ebene zu verstehen.
Schlussfolgernd lässt sich bereits jetzt sagen, dass Wnt1 als sehr potentes osteoanaboles
Molekül angesehen werden kann. Genau deshalb ist ein Verständnis des zugrundeliegenden
Mechanismus, mit speziellem Fokus auf der Identifizierung eines Rezeptors, als bedeutender
Schritt zur Entwicklung osteoanaboler Therapien anzusehen, womit Osteoporose und andere
Knochenerkrankungen besser behandelt werden könnten.
Johannes Möller
Masterarbeit im Studiengang Bioverfahrenstechnik
Technische Universität Hamburg
Institut für Bioprozess- und Biosystemtechnik
Denickestraße 15
21073 Hamburg
[email protected]
Hamburg, 20.03.2015
Modellgestützte Simulation zur Optimierung von
Kultivierungsparametern einer CHO-Zelllinie
Die Verbesserung komplexer biotechnologischer Produktionsprozesse mit statistischen
Optimierungsverfahren ist Stand der Technik. Dabei werden Kultivierungsparameter
innerhalb vertrauenswürdiger Grenzen festgelegt, mit statistischen Algorithmen variiert und
für jede Parameterkombination in einer mehrtägigen Kultivierung umgesetzt. Die große
Anzahl real durchzuführender Experimente ist zeit- und kostenintensiv und stellt kleine und
mittelständige Unternehmen vor große Herausforderungen. Die Festlegung von Grenzen
erfolgt dabei heuristisch, so dass optimale Betriebspunkte nicht zwangsläufig gefunden
werden und die Grenzen schrittweise iterativ verkleinert werden müssen.
Die Verknüpfung modellgestützter Wachstumsmodelle mit statistischen
Optimierungsverfahren könnte deshalb eine Alternative zur vorherigen Eingrenzung
relevanter Kultivierungsparameter in silico sein. Das Ziel ist, die Anzahl durchzuführender
Experimente zu verringert und Bereiche maximaler Zielgrößen vor realen Experimenten
einzugrenzen. Gleichzeitig können verschiedene Prozessführungsstrategien untersucht und
im Vorfeld beurteilt werden.
Zur Optimierung von Kultivierungsparametern der rekombinanten Säugetier Zelllinie
CHO-XM-111-10 (CCOS 837) wurde ein unstrukturiertes, nicht-segregiertes
Wachstumsmodell modifiziert und etabliert. Dafür wurden die Biomasse, Substrat- und
Produktkonzentrationen während einer batch-Kultivierung aufgezeichnet und das
Wachstumsmodell durch eine mehrdimensionale, nicht-lineare Optimierung an die
Messdaten angepasst. Anschließend wurde ein mehrstufiger Produktionsprozess mit
Mediumwechsel und konstanter Fütterung (fed-batch) in silico optimiert und validiert.
Die Anzahl real durchzuführender Experimente konnte durch die vorherige Simulation
deutlich verringert werden. Gleichzeitig gelang es, einen mehrstufigen Produktionsprozess
zu simulieren. Die so etablierte Methode stellt deshalb eine Alternative zur rein statistischen
Optimierung dar und kann zur Effizienzsteigerung von Produktionsprozessen genutzt
werden.
Bachelorarbeit: „Analyse der Konusverbindungen nach Wiederbenutzung und Fehlpaarung“
von Mandy Körner
Technische Universität Hamburg-Harburg
Abstract
Ziel
Die Verwendung von keramischen Komponenten in der Hüftendoprothetik hat neue
Maßstäbe für die Biokompatibilität und die Verschleißfestigkeit gesetzt. Jedoch sind durch
das spröde Materialverhalten von Keramik auch Probleme entstanden. Beispielsweise kann
der Keramikkopf im Patienten brechen, wenn z.B. inkompatible Komponenten (Fehlpaarung)
verwendet werden. Bei der Revisionsoperation eines solchen Bruches muss sich der Arzt die
Frage stellen, ob der Schaftkonus wiederverwenden kann oder ob die komplette Prothese
gewechselt werden muss. Ziel dieser Arbeit war es, anhand einer Fehlpaarung und eines
wiederbenutzen Schaftkonus zu untersuchen, inwiefern erhöhte Spannungen im
Keramikkopf zu einer Reduzierung der Bruchlast führen. Die Ergebnisse sollen Ärzten
Entscheidungshilfen geben und auf längere Sicht zu einer intraoperativen Beurteilung der
Schaftkonen beitragen.
Methoden
Es wurden Berstlastversuche mit fünf Kopf-Schaftkonus Fehlpaarungen mit einer
Winkeldifferenz von 1,7 ° (vorhergesehene Paarung: 0,09 °) durchgeführt. Die beschädigten
Schaftkonen wurden makroskopisch und mikroskopisch untersucht. Des Weiteren wurden
mit Hilfe der Finite-Elemente-Methode Modelle einer Fehlpaarung und eines beschädigten
Schaftkonus erstellt und validiert. Zum Vergleich wurde zusätzlich eine reguläre Paarung
simuliert. Es wurden die verschiedenen Verläufe der maximalen Zugspannungen in
Abhängigkeit der Reaktionskräfte miteinander verglichen.
Ergebnisse
Die gemessenen Bruchlasten der Fehlpaarung zeigten eine signifikante Reduzierung
gegenüber einer vorhergesehenen Paarung. Dies konnte auch in der Finite-ElementeSimulation beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Modellierung zeigten eine deutliche
Erhöhung der Zugspannungen bei gleicher Last, sowohl bei den Fehlpaarungen, als auch
bei dem beschädigten Schaftkonus. Zusätzlich konnten 45 durch Keramikkopfbruch
entstandene Schäden mikroskopisch vermessenen und in Bezug auf ihre Geometrie
katalogisiert werden.
Schlussfolgerung
Die verringerten Bruchlasten der Fehlpaarungen erhöhen das Risiko eines in-vivo
Keramikbruches. Daher ist die Verwendung einer Fehlpaarung unbedingt zu vermeiden.
Auch der beschädigte Schaftkonus erzeugt laut Finite-Elemente-Simulation ein erhöhtes
Bruchrisiko, was vorhergegangene Testungen bestätigen. Um eine qualitative Aussage über
die Wiederverwendung eines beschädigten Schaftkonus treffen zu können, müssen jedoch
weitere Geometrien und Größen der Schäden untersucht werden. Nach aktueller Sachlage
muss für alle Hüftoperationen gelten: Kopf-Schaft Fehlpaarungen sowie die
Wiederverwendung von Schäften nach einem Keramikkopfbruch müssen unbedingt
vermieden werden.
Bachelorarbeit – Kann ein Eisbein Schmerzen lindern?
Entwicklung einer thermischen Fügemethode für Prothesenelemente
Tobias Konow, Annika Krull, Henning Haschke, Adrian Falkenberg, Michael M. Morlock
Institut für Biomechanik, Technische Universität Hamburg-Harburg
Einleitung
Modulare Hüftendoprothesen bestehen aus einem Prothesenkopf und einem Prothesenschaft, welche
über eine Konusverbindung miteinander verbunden sind. Nach dem derzeitigen Stand der Technik
werden die Prothesenkomponenten intraoperativ durch den Chirurgen mit „leichten Schlägen“ fixiert.
1
Kräfte zwischen 2kN und 4kN werden dabei impulsförmig auf die Konusverbindung ausgeübt .
Allerdings ist weder die Fügekraft noch die Fügemethode genormt. Mroczkowski et al. (2006) zeigten,
dass höhere Fügekräfte zu einer Spannungserhöhung in der Konusverbindung, sowie geringeren
2
Relativbewegungen zwischen den Prothesenkomponenten führen . Relativbewegungen zwischen
Prothesenschaft und -kopf können im Zusammenhang mit einem in-vivo vorliegenden chemischaggressiven Umgebungsmilieu korrosive Veränderung an den Flächen der Konus-verbindung
hervorrufen, die Freisetzung von Abriebpartikeln begünstigen und eine aseptische
Prothesenlockerung bewirken. Ein operativer Austausch (Revision) der Hüftendoprothese wird
notwendig. Ziel dieser Bachelorarbeit ist die Entwicklung einer alternativen Fügemethode, welche
eine höhere Festigkeit zwischen den Prothesenkomponenten generiert und durch das Verhindern
einer frühzeitigen Revision dem Patienten eine bessere Lebensqualität bietet.
Material & Methode
Mittels Brainstorming und Literaturrecherche (auch in angrenzenden Themenfeldern) werden Alternativen zur Realisierung einer Kopf-Schaft-Verbindung herausgearbeitet. Adaptiert aus dem
Maschineningenieurswesen wird eine thermische Fügemethode auf die Konusverbindung angewendet. Ein Prothesenschaft (Ti6Al4V) wird in einem Kühlmedium um ∆T=-100K abgekühlt. Im
gekühlten Zustand wird der Prothesenschaft axial mittels einer definierten Fügekraft mit einem
Prothesenkopf (CoCr29Mo) gefügt. Dabei werden Kraftstufen entsprechend intraoperativ ermittelter
1
Fügekräfte (F1 = 2kN, F2 = 4kN) verwendet . Die Bestimmung der Festigkeit der Konusverbindung
erfolgt über die Ermittlung der Abzugskraft.
Die Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen werden numerisch mittels Finiter ElementeMethode (FEM, Abaqus CAE 6.14) validiert. Zudem wird der Einfluss einer abweichenden Materialzuweisung, sowie die Zulässigkeit einer umgekehrten Konusgeometrie untersucht. Der thermische
Fügevorgang wird unter Berücksichtigung der experimentell verwendeten Kraftstufen simuliert und die
Abzugskräfte ermittelt. Der Einfluss der Fügetemperatur wird zusätzlich untersucht.
Ergebnisse
Sowohl die experimentellen als auch die numerischen Ergebnisse zeigen einen signifikanten Anstieg
der Abzugskraft (F ab-normal = 0,5kN vs. F ab-thermisch = 7,2kN) bei einem thermischen veränderten Fügevorgang gegenüber der herkömmlich temperierten Konusverbindung (p<0,001). Deutlich höhere
Spannungen bei thermischer Fügung können in allen FE-Modellen nachgewiesen werden. Der
thermische Einfluss auf die Festigkeit der Verbindung wird durch eine lineare Funktion beschrieben
2
(R =0.99).
Diskussion
Eine thermische Erwärmung des Prothesenkopfes ist aufgrund von Werkstoffeigenschaften und
Verletzungsgefahr nicht zulässig. Eine umgekehrte Konusgeometrie erlaubt das Abkühlen des
Prothesenkopfes. Eine mögliche Kondensatbildung auf dem Prothesenschaft kann die Festigkeit der
Verbindung beeinflussen. Die Verletzungsgefahr von umliegendem Gewebe durch Kälteverbrennungen ist bei der Implantation jedoch zu beachten. Die Kühlung des Prothesenkopfes muss interoperativ möglich sein. Ist eine sichere Implantation gewährleistet, kann eine thermische Fügemethode
die Lebensqualität des Patienten durch eine längere Standzeit deutlich verbessern.
1
Nassutt, R. et al. 2006. Die Bedeutung der Setzkraft für die Sicherheit einer Konuskopplung von Hüftstiel und
kerami-schem Prothesenkopf. Biomed. Tech., 51(2), 103–9.
2
Mroczkowski, M et al. 2006. Effect of impact assembly on the fretting corrosion of modular hip tapers. Journal of
ortho-paedic research 24(2), 271–279.
Bachelorarbeit: Evaluation verschiedener Ultraschall Hand-Auge Kalibrierverfahren
Autor: Hanna Messing
Betreuer: Sven-Thomas Antoni
Institut für Medizintechnische Systeme, Technische Universität Hamburg-Harburg
Abstract
Ziel
Ziel dieser Arbeit ist die Bestimmung der Lage und Orientierung einer Ultraschallbildebene im
Koordinatensystem eines Trackingsystems. Dazu wird ein Tracker am Ultraschallkopf befestigt,
dessen Lage und Orientierung jederzeit von dem Trackingsystem gemessen werden kann. Was
also gesucht wird, ist eine Transformationsmatrix, die das Koordinatensystem der Bildebene auf
das Koordinatensystem des Trackers am Ultraschallkopf abbildet, die sogenannte Kalibriermatrix.
Wenn man diese kennt, kann man von einem Objekt 3D-Ultraschallbilder erstellen, indem man
2D-Ultraschallbilder von diesem Objekt aufnimmt und der Lage und Orientierung im Raum
entsprechend zusammenfügt.
Methoden
Um eine Kalibrierung durchzuführen, wird ein Phantom benötigt, dessen Aufbau bekannt ist.
Nimmt man Ultraschallbilder von diesem Phantom auf, kann durch eine Transformation
bestimmter Pixel aus dem Ultraschallbild auf das Koordinatensystem des Phantoms ein
Gleichungssystem erstellt werden, das man nach der Kalibriermatrix lösen kann.
In dieser Arbeit wurden zunächst einige solcher Phantome vorgestellt. Anschließend wurde eine
Kalibrierung mit einem N-Wire Phantom durchgeführt. Um die Kalibriermatrix mit Hilfe eines NWire Phantoms zu berechnen, gibt es zwei Möglichkeiten, die miteinander verglichen wurden.
Bei der ersten Möglichkeit werden die Schnittpunkte der Bildebene mit den mittleren Fäden der
N's berechnet. Aus der Transformation eines Schnittpunktes des mittleren Fadens eines N's mit
der Bildebene aus dem Koordinatensystem der Bildebene auf das Koordinatensystem des
Phantoms können aus jedem N in jedem Bild drei Gleichungen erhalten werden, aus denen das
erwähnte Gleichungssystem aufgestellt werden kann. Das Gleichungssystem wurde mit dem QRVerfahren gelöst.
Die zweite Möglichkeit besteht darin, die Fäden auf das Koordinatensystem des Ultraschallbildes
zu transformieren und den Schnittpunkt mit der Bildebene zu berechnen. Aus dem Abstand der
transformierten Schnittpunkte zu den tatsächlichen Punkten im Bild, kann eine Funktion
aufgestellt werden, die abhängig von der Kalibriermatrix ist. Die gewünschten Werte der
Kalibriermatrix findet man im Minimum dieser Funktion. Die Funktion wurde mit dem LevenbergMarquardt Algorithmus minimiert.
Um die benötigten Pixel im Ultraschallbild zu finden, wurde eine Bildverarbeitung erstellt, die die
Schnittpunkte der Fäden des N-Wire Phantoms mit den Ultraschallbildebenen in den Bildern
automatisch erkennt und den entsprechenden Fäden zuordnet.
Die Genauigkeit der Kalibriermatrix wurde mit Hilfe eines Crosswire Phantoms überprüft.
Der durchschnittliche und der maximale Abstand der aus dem Koordinatensystem des
Ultraschallbildes auf das Koordinatensystem des Crosswire Phantoms transformierten
Schnittpunkte der Fäden zu dem tatsächlich im Phantom ausgemessenen Schnittpunkt der
Fäden sind ein Maß für die Genauigkeit der Kalibriermatrix.
Ergebnisse
Die Kalibrierung wurde mit 41 Ultraschallbildern durchgeführt. Aus diesen 41 Bildern konnten die
Punkte bei 11 Bildern fehlerfrei erkannt werden. Die restlichen Bilder wurden bei der Kalibrierung
nicht weiter beachtet. Bei einer Kalibrierung eines Sektorschallkopfes nach der ersten Methode
konnte mit den Bildern aus der Bildverarbeitung eine durchschnittliche Abweichung von 3,01 mm
und eine maximale Abweichung von 4,38 mm erreicht werden. Mit der zweiten Methode konnte
bei einer Auswahl der Punkte per Hand aus 41 Bildern eine durchschnittliche Abweichung von 6,5
mm und eine maximale Abweichung von 7,79 mm erreicht werden.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse sind bereits vergleichbar mit den Ergebnissen ähnlicher Arbeiten, sind allerdings
noch nicht optimal. Mögliche Ungenauigkeiten können beim Vermessen des Phantoms
entstanden sein. Durch die Wahl der Materialien des Phantoms können Reflektionen entstehen,
die die Bildqualität verschlechtern und damit auch die Qualität der Kalibrierung. Durch die
Bildverarbeitung konnte der Kalibriervorgang wesentlich beschleunigt werden.
Benjamin Hollmach – TUHH
Robotergestützte Ultraschall-Elastographie (Studienarbeit [Projektarbeit])
Abstract
Ziel: In den letzten Jahrzehnten haben sich die Möglichkeiten der Ultraschalldiagnostik
drastisch verbessert. Beispielsweise ist mittlerweile die Echtzeit-Elastizitätsmessung von
Gewebe in vielen Geräten bereits implementiert. Diese Elastographie ermöglicht es, aus den
Ultraschalldaten zusätzlich pathologische Gewebeeigenschaften zu gewinnen, die in einer
alleinigen Ultraschalluntersuchung nicht zu erkennen wären. Ein Nachteil dieses Verfahrens
ist allerdings, dass die Ergebnisse sehr stark vom Bediener und dessen Erfahrung abhängig
sind. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Möglichkeiten einer robotergestützten Elastographie
auszuloten und die Rahmenbedingungen für weiterführende Untersuchungen zu schaffen.
Dazu muss vor allem eine Anleitung für reproduzierbare Phantome verschiedener
Eigenschaften erstellt und diese mit der robotergestützten Elastographie ob ihrer Eignung
verifiziert werden. Besonderes Augenmerk liegt bei diesen Phantomen auf Einschlüssen, die
im Ultraschallbild schlecht oder gar nicht zu erkennen sein sollen und erst mittels
Elastographiebild sichtbar werden.
Methoden: In mehreren Iterationen werden verschiedene Stoffkombinationen wie Gelatine
oder Silikon verwendet, um ein Phantom mit Einschlüssen definierter Form zu schaffen. Um
die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wurden diese unter anderem mithilfe von 3Dgedruckten Formen hergestellt. Überprüft wurden die Phantome mit einem Ultrasonix
Ultraschallgerät, das auch in der klinischen Praxis Verwendung finden kann und einem
Universal Robotics Roboter Arm, der den Ultraschallkopf führte und die benötigten
Bewegungen für die Elastographie ausführte.
Ergebnisse: Wir haben eine Konfiguration für Gelatine-Phantome mit Gelatine-Einschlüssen
erfolgreich erprobt, die in einem einfachen Ultraschallbild fast nicht, aber mit dem
Elastographiemodus deutlich zu erkennen sind. Diese Phantome können vergleichsweise
schnell, mit einfachen Mitteln, kostengünstig und mit kleinen Varianzen reproduziert werden.
Durch ihre E-Modulwerte, die im Bereich von circa 20-70 KPa liegen, sind sie für die
Approximation menschlichen Gewebes gut geeignet. Die Elastographiemessungen können
zerstörungsfrei vorgenommen werden und mit entsprechender Kühlung können die
Phantome mehrere Wochen aufbewahrt und wiederverwendet werden.
Schlussfolgerung: Diese Arbeit ermöglicht es, die robotergestützte Elastographie weiter zu
untersuchen und Ergebnisse in vitro zu verifizieren.
HDR Brachytherapie – Behandlungsplanung
Die Verwendung der HDR Brachytherapie ermöglicht bei der Behandlung von Krebs eine präzisere
Bestrahlung des Tumors. Dafür werden mit Hilfe von Nadeln radioaktive Präparate (Seeds) in das
Tumorgewebe eingebracht. Dabei besitzen die Positionierung und die Verweildauer der Seeds eine
große Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit ist eine Implementierung verschiedener Algorithmen
(lineare/schrittweise lineare Programmierung[LP/SLP], genetischer Algorithmus [GA], Simulated
Annealing [SA]), zur Optimierung der Verweildauer der Präparate sowie der Flexibilität selbiger in
Hinsicht auf verschiedene Anforderungen und Ziele. Die Ergebnisse können dann für die Erstellung
eines Behandlungsplans genutzt werden. Zur weiteren Verbessung wird eine Klassifizierung und die
Nutzung bestehenden Wissens in Betracht gezogen.
Die genannten Algorithmen werden trivial implementiert und mit einer distanzabhängigen
Dosisfunktion versehen (Abweichungen durch Gewebe sind ausgenommen). Zusätzlich wird
insbesondere der genetische Algorithmus bezüglich Laufzeit optimiert. Dabei werden die
verschiedenen Parameter und Einstellmöglichkeiten aufgezeigt (bspw. Wahrscheinlichkeiten beim
GA, Anzahl der Seeds, Relaxierung der Nebenbedingungen und Anpassung der Zielfunktion für LP und
LSP, Anpassung der Temperatur sowie der Anzahl Random Restarts beim SA). Zur Evaluation werden
u.a. die Abdeckung des Tumors mit der gewünschten Strahlung und die Konformalität mit den
Zielvorgaben betrachtet. Abschließend wird eine Klassifikation der Körper anhand von
Gewebeparametern untersucht.
Wie diese Arbeit zeigt, kann mittels linearer Programmierung ein Algorithmus implementiert werden,
der nur mit der Anzahl der Seeds skaliert und durch eine geeignete Wahl der Nebenbedingungen den
Körper des Patienten – im Vergleich zu GA und SA - am besten modelliert. Zusätzlich dazu erlaubt LSP
eine schrittweise Adaption der Nebenbedingungen, was ein besseres Ergebnis bei einer höheren
Laufzeit erzeugt.
Die Analyse des genetischen Algorithmus hat ergeben, dass eine naive Implementierung der FitnessFunktion zu einer extrem hohen Laufzeit führt. Dies lässt sich durch geeignete Optimierung beheben.
Des Weiteren hat sich ergeben, dass eine gewichtete Fitness-Funktion besser angepasste
Optimierungen erzeugen kann. Die Einstellung dieser Gewichte ist jedoch individuell für jeden
Patienten nötig, um ein ideales Ergebnis zu erzielen.
Im Gegensatz zum GA bietet das Simulated Annealing eine kürzere Laufzeit bei ähnlichem Ergebnis.
Nutzt man die Möglichkeit der Random Restarts, ist die Laufzeit jedoch höher. Leider verbessert sich
das Ergebnis durch Random Restarts in den meisten Fällen nicht. Zudem besitzt es eine
eingeschränktere Anpassungsmöglichkeit an das Problem, da weniger Parameter zur Verfügung
stehen.
Wie anhand der Ergebnisse erkennbar ist, bieten GA und SA im Vergleich zu LP/LSP eine höhere
Flexibilität. Dabei sticht GA besonders hervor. Im Gegensatz dazu besitzt LP/LSP eine konstante
Laufzeit. Zusätzlich stimmt in der Regel das Ergebnis mit den Vorgaben stärker über ein, was eine
bessere Kontrolle ermöglicht. Jedoch ist in jedem Fall ein Kompromiss zwischen Laufzeit und Güte
des Ergebnisses zu finden. Letztlich kann eine Klassifizierung des Problems und eine damit
verbundene Nutzung von geeigneten Startwerten die Laufzeit und Güte verbessern; dies ist noch
genauer zu untersuchen.
Autoren dieser Projektarbeit: Sebastian Elm, Laurin Mordhorst, Thobias Karthe, Malte Erik Schröder
Betreuung: Prof. Alexander Schläfer, Sven-Thomas Antoni
Studententagung 2015 - Abstract
Expression eines von NK-Lysin abgeleiteten antimikrobiellen Peptides in
Pichia pastoris SMD 1168
Jan Demmer1, Jakob Brandt1, Patrick Ziegelmüller2, Jörg Andrä1, Gesine Cornelissen1
1. HAW Hamburg, Fakultät Life Science, Department Biotechnologie, Ulmenliet 20, 21033 Hamburg
2. Universität Hamburg, Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Department of Chemistry, Martin-Luther-King Platz 6, 20146 Hamburg
Einleitung
Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind Peptide mit einer Länge von ca. 20 bis 40 Aminosäuren,
die natürlicherweise z. B. in der Schleimhaut von Fröschen oder im Bienengift vorkommen.
Charakteristisch ist die häufig helikale, amphiphile Sekundärstruktur. Meist liegen
hydrophobe und hydrophile Gruppen gegenüber der Längsachse der Helixstruktur, was dazu
führt, dass die Peptide mit der Zellmembran interagieren können. Die Membran wird letztlich
lysiert, sodass die Mikroorganismen absterben.
Bis heute wurden faktisch keine Resistenzen gegen AMPs beschrieben. Der Grund dafür
liegt vermutlich in der rein physikalischen Wirkungsweise der Peptide. Somit sind AMPs
vielversprechende Kandidaten für den Einsatz als neuartige Antibiotika in der
Humantherapie.
Ein weiteres Einsatzgebiet für AMPs ist die Onkologie. Bei krebsartig veränderten Zellen ist
der natürliche Aufbau der Zellmembran gestört. Negativ geladenes Phosphatidylserin,
welches in gesunden Zellen nur auf der Innenseite der Zellmembran vorkommt, wird auch an
der Außenseite beobachtet. Die positiv geladenen AMPs können sich so spezifisch an
Krebszellen anlagern, wodurch sich neue Möglichkeiten für die Behandlung von Tumoren
ergeben.
Beschreibung des Projektes
In diesem Projekt soll ein AMP in der Hefe P. pastoris rekombinant exprimiert werden. Es
handelt sich dabei um eine stark verkürzte Variante von NK-Lysin, welches erstmals in
NK-Zellen von Schweinen nachgewiesen wurde. Das so erhaltene Peptid hat eine helikale
Struktur und eine Länge von 27 Aminosäuren. Die DNA-Sequenz des Peptids wurde in das
Genom von P. pastoris SMD 1168, einem Stamm mit niedriger Proteaseaktivität, hinter dem
Alkoholoxidase-Promotor (AOX) eingefügt. Bei P. pastoris handelt es sich um eine
methylotrophe Hefe, die neben Glycerin auch Methanol als C-Quelle nutzen kann. Wenn
Methanol die einzige C-Quelle ist, werden der AOX-Promotor aktiviert und die
dahinterliegenden Gene abgelesen. Das Zielpeptid wird exprimiert.
Die Expression soll in einem hoch instrumentierten Bioreaktor stattfinden, welcher pH-Wert,
Sauerstoffkonzentration, Temperatur und die Methanolkonzentration regelt. Des Weiteren
lassen sich Parameter wie Druck, Leitfähigkeit und optische Dichte messen. Der
Kohlenstoffdioxid- und Sauerstoffgehalt im Abgas wird für die Beschreibung weiterer Größen
verwendet. So können stoffwechselphysiologische Vorgänge und die Expression
charakterisiert werden.
Im Anschluss an die Fermentation soll das Peptid aus den zellfreien Überständen
aufgereinigt und hinsichtlich seiner antibakteriellen Wirkung in einem Agarosediffusionstest,
sowie in seiner Aktivität gegenüber Modellmembranen, im Vergleich mit einer synthetisch
hergestellten Variante des Peptides, beschrieben werden.
Somit ist das Ziel des Projektes die Etablierung eines robusten Verfahrens, welches sich
auch auf weitere Prozesse zur Produktion anderer AMPs übertragen ließe.
Studententagung 2015 - Abstract
Optimierung der Prozessbedingungen zur Stabilisierung eines potentiellen
Malariaimpfstoffes in Fed-Batch-Prozessen mit Pichia pastoris
Janko Lucks, Roman Gräf, Gesine Cornelissen
HAW Hamburg, Fakultät Life Science, Department Biotechnologie, Ulmenliet 20, 21033 Hamburg
Malaria ist eine in tropischen Ländern weit verbreitete Krankheit, der lt. WHO pro Jahr knapp
eine Million Menschen zum Opfer fallen. Davon sind ca. die Hälfte Kinder. Ein hilfreicher
Schutz für die wirtschaftlich schwache Zielgruppe wird in einem Impfstoff gegen Malaria
gesehen.
Das Fusionsprotein D1M1, bestehend aus zwei Antigenen des Malariaerregers Plasmodium
falciparum, gilt als aussichtsreicher Kandidat für solch ein Vakzin. Seine histidinreiche Prodomäne ermöglicht die Aufreinigung via IMAC. Für eine GMP-gerechte und kosteneffiziente
Produktion eignet sich als Expressionssystem insbesondere Pichia pastoris. Diese methylotrophe Hefe wächst gut auf mineralischen Medien und verfügt über ein effizientes Induktionssystem, welches durch Methanol-Zugabe aktiviert wird.
Während der Kultivierung mit P. pastoris ist eine Degradation des Zielproteins beobachtet
worden, welche möglicherweise auf Proteolyse im Medium zurückzuführen ist. Um eine Verbesserung der Stabilität, Qualität und Ausbeute des Produkts zu erzielen, wird versucht, über
die Optimierung der Prozessbedingungen den Abbau des D1M1 im Medium zu minimieren.
Jahic et al. (2003) berichten von einer nicht mehr nachweisbaren proteolytischen Degradation und einer signifikant erhöhten Produktausbeute bei niedrigeren Kultivierungstemperaturen.
Zur kostengünstigen Herstellung des Zielproteins erfolgt eine zyklische Kultivierung von
P. pastoris. Charakteristisch für diese Prozessstrategie sind die einander abwechselnden
Fed-Batch- und Produktionsphasen. Nach einer einmaligen Zellanzucht in der Batch-Phase
wird die Zielzelldichte für den Beginn der Produktion durch Nachfütterung des primären
Substrats Glycerin erreicht. Ein Substratwechsel auf Methanol induziert die Produktion des
Zielproteins. Regelmäßig wird ein Teil der produkthaltigen Kulturbrühe abgeerntet und durch
frisches Medium ersetzt. Vor der nächsten Produktionsphase erfolgt eine weitere Fed-BatchPhase, um den Verlust an Zellmasse auszugleichen. Nachdem die Zielzelldichte wieder
erreicht ist, startet die nächste Produktionsphase.
Dem im Kultivierungsverlauf größer werdenden Anteil beschädigten Zielproteins in der
Kulturbrühe soll durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen begegnet werden. Die
Spaltprodukte können mit der gängigen Reinigungsstrategie nicht separiert werden und sind
damit besonders problematisch bei der Formulierung eines reinen Produkts.
Basierend auf vorangegangenen Arbeiten soll im Speziellen der Einfluss tiefer Kultivierungstemperaturen untersucht werden. Zu diesem Zweck ist ein Screening des mit diesem
Produktionsstamm bislang unerforschten Temperaturbereichs von 10 °C bis 20 °C mit Schüttelkolbenkulturen vorgesehen. Das dabei festgestellte Temperaturoptimum dient dann als
Startpunkt
für
die
Optimierung
im
Bioreaktor.
Jahic, M., Wallberg, F., Bollok, M., Garcia, P., Enfors, S.-O., 2003. “Temperature Limited Fed-Batch Technique for Control of Proteolysis in Pichia
Pastoris Bioreactor Cultures.” Microbial Cell Factories 2 (1): 6.

Funktionelle Charakterisierung purinerger Rezeptoren und

Menüplan Restaurant TRIAGO

Freitag, 29.4.2016 16.10–17.00 Freie Vorträge Plenarsaal 16.10 PD

Chemielaborant/in oder Chemisch Technische(r

Datenblatt Ebo 64 S / M / L - Wiesheu

Anleitung und Einteilung - Kantonsschule Kreuzlingen

7. Zwischenmolekulare Kräfte

Beziehungskennzeichnungen für die Felder 3010 und 3110

Beziehungen und Beziehungskennzeichnungen 1

FIGU-Zeitzeichen Nr. 02

PNS III

Was ist Bentonit

Stark, stärker, Powerbank cmx® EBP 22C

Dokument 1 - SciDok - Universität des Saarlandes

Am Anfang stand nur eines fest: Die Optimierung der Ablaufprozesse