Zellbiologie Signaltransduktion und angeborene Immunität Smooth muscle cells Neutrophil Eosinophil Basophil Erythrocyte Osteoclast T-cell B-cell Mesenchymal cells Macrophage FcRI Mast cell FcRI Epithelial cells Dendritic cells Signale Zellantwort Im Gewebsverband erhalten Zellen zusätzliche Signale von benachbarten Zellen Signale Zell-ZellInteraktion Zell-ZellInteraktion Zellantwort Zellen müssen Informationen erhalten und adäquat verarbeiten Zellen müssen Informationen erhalten und adäquat verarbeiten 1. Erkennung Rezeptoren 2. Übersetzung Signaltransduktion Zellen müssen Informationen erhalten und adäquat verarbeiten 1. Signal 2. Erkennung Rezeptoren 3. Übersetzung Signaltransduktion Zellen müssen Informationen erhalten und adäquat verarbeiten 1. Signal 2. Erkennung Rezeptoren 3. Übersetzung Signaltransduktion 4. Effektuierung Proteinmodifikation etc Signalstoffe sind entweder hydrophil oder hydrophob 1. Signal 2. Erkennung Dopamine 3. Übersetzung 4. Effektuierung Hydrocortisone Signalstoffe sind entweder hydrophil oder hydrophob Hydrophil Hydrophob Dopamine 1. Signal 2. Erkennung 3. Übersetzung 4. Effektuierung membranständige Rezeptoren zytosolische Rezeptoren Hydrocortisone Rezeptoren erkennen das Signal sehr spezifisch - Sie leiten das Signal in die Zelle 1. Signal 2. Erkennung Dopamine Adrenalin 3. Übersetzung 4. Effektuierung Adr 4 s GDP Adr 5 66 5 4 s GTP AC s AC GTP Other signaling events cAMP Signaltransduktion – Signale werden in die Sprache der Zelle übersetzt – Unterschiedliche Wege Phosphorylierungskaskaden Second messenger 1. Signal 2. Erkennung 3. Übersetzung 4. Effektuierung Effektuierung – wie ändert ein Signal die Zellantwort Kovalente Proteinmodifikationen Nicht-kovalente Proteinmodifikationen Abbau von Proteinen 1. Signal 2. Erkennung 3. Übersetzung 4. Effektuierung De novo Synthese von Proteinen 5HT Grb2 Cbl S GTP AC Cbl AC GAB2 Sos Y807 Y807 Ras NIK c EGF TGF CR1 CR1 FN III FN III TGF Box Y704 Y729 Y729 Y744 Y764 Y764 TGF TGF TGF RII TGF RI T204 RII RI GS KinaseKinase Kinase Kinase TNF FN III FN III Box-1 Box-1 Box-1 JAK-1 Box-2 Box-2JAK-2 Box-2 P C-Lobe C-Lobe Y577 P S585 PY612 P Y577P S585 PY695 PY750 Y695 Y806 Y806 Y866 Y866 Oscar R1 R1 R1 Box Box DD DD DD Y612 Y750 P IL-7R IL-7R RIP FcR Src Y449 DAP 12 ITAM P SYK kinase Y744 JM JM P Smad 2 Box Y704 RI IL-7 TRADD RII TIR c FN FN III IL-3 III FN FN III III EGF TIR pY Tpl2 Mek 1/2 TLR3 PDZ SAM binding Raf G-CSF Motif 1 Motif 1 P TRAF6 TAB2 Motif 1 Motif 2 Motif 2 P P TAK1 TRAF6 P 2 MotifMotif 3 Motif 3 TAB1 Limd1 S526 MEKK3 Motif 3 Src TK Y697 Y697 Y721 Y721 SYK G i GAB2 TK TLR3 TRADD Y559 Y559 Src TK Src PYK Ephrin B FSH JM Y402 RANK RANK RANK Ig Ig Ig Ig Ig Ligand CRD FN IIIFN III β3 αv Ephrin A RANKL RANKL RANKL Y304 CSF-1 Ig Ig Ig Ig Ig PDZ binding Rezeptoren ITAM S465 S467 LBP MD-2 CD40CD40 INFR1 BTK TRAMMAL DD IRAK 1 P Y TAB2 TAB2 Kinase Kinase TRAF6 P MyD88 PI3K Kinase TRAF4 Kinase TRAF2 PLC1 TRIF Y457 IRAK 4 TIR TIR P IL-10 R2 Box TYK-2 Box Box DD DD IRAKIRAK 4 1 Bcl10 R1 MyD88 Y457 Box INFR1 IL-1 IL-1 R1 RAp Y Y446 Y446 Y496 Y496 IRAK4 Kinase Box CD14 MyD88 G q IL-1 TLR4 TLR4 CD40L INF LPS ITAM ITAM ZAP70 PLC Signaltransduktion – Signale werden in die Sprache der Zelle übersetzt - Growth Hormone Signaling GH SOCS1 pY JAK-2 Box Box PY Grb2 SOS Ras IP3 IRS-1 Y391 Ca Y391 PI3K STAT5 PY Y569 14-3-3 Ca Ca Mek 1/2 Erk 1/2 P PLC1 Y705 Raf KSR P Y569 PDK PKC DAG Ca CaM Ca P STAT5 P Bad Y705 FKBP12 P Y705 Ca Ca p70S6K PKB mTOR Raptor STAT5 P Bcl-2 Cas 9 CaM CamKII Tau GL P P MAP1B P P FOXO1 P S6 4EBP1 P MARCKS P MDM2 P Cot P Fascin P P27P P XIAP S9 P CRMP-2 CaM P MLCK Glycogen synthase GSK-3 cytoplasm P P 60S 40S STAT5 Y705 Y705 STAT5 AAAAA IGF, casein,Sp i2.1, ALS, insulin,H NF-6, AAAAA -Catenin P APC WNK-1 P P CRECRE P P AP-1AP-1 P Typen von Rezeptoren 1. Signal 2. Erkennung 3. Übersetzung 4. Effektuierung Wichtigste Typen von Membranrezeptoren auf der Zelloberfläche: A. B. C. Ionenkanal-Rezeptoren G-Protein gekoppelte Rezeptoren Enzymgekoppelte Rezeptoren Rezeptoren im Zellinneren: D. Rezeptoren für Steroid- und Schilddrüsenhormone, NO 1. Signal A) Ionenkanal-Rezeptoren 2. Erkennung 3. Übersetzung 4. Effektuierung Ligandengesteuerte Ionenkanäle sind Proteinporen in der Plasmamembran Chemisches Signal Öffnen oder Schließen des Ionenkanals Konzentrationsänderung bestimmter Ionen, z.B. Na+, Ca2+ Antwort der Zelle B) G-Protein gekoppelte Rezeptoren ... wechselwirken mit einem intrazellulär an der Membran verankertem G-Protein (= GTP bindendes Protein), das das Signal weiterleitet. ... bilden die größte Familie der Zelloberflächen-Rezeptoren aus (~1000 involviert in Geruchserkennung). ... binden eine Vielzahl von unterschiedlichen Signalmolekülen. ... kommen in verschiedenen Familien vor (z.B. Adrenalin bindet an mind. 9 verschiedene Rezeptoren). Nobelpreis 1994 an Gilman und Rodbell "for their discovery of Gproteins and the role of these proteins in signal transduction in cells". Alfred G. Gilman (1941-) Martin Rodbell (1925-1998) Struktur G-Protein gekoppelter Rezeptoren Sieben Transmembran Helices Beispiel: Struktur von Rhodopsin G-Proteine als molekularer Schalter G-Proteine als molekularer Schalter G-Proteine wirken als ‘Schalter’ – ‘ein’ oder ‘aus’ ‘aus’ GDP gebunden ‘ein’ GTP gebunden G-Proteine • G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten: α, β, γ. • α und γ Untereinheit sind auf der cytosolischen Seite der Membran verankert. • α Untereinheit bindet GDP oder GTP. • Verschiedene Typen von G-Proteinen für bestimmte Rezeptoren und bestimmte Zielmoleküle. Inaktiver Zustand: Aktivierung der G-Proteine Bindung eines extrazellulären Signalmoleküls Konformationsänderung des Rezeptors Konformationsänderung des G-Proteins Austausch von GDP gegen GTP Dissoziation α-Untereinheit βγ-Untereinheit Aktivierung weiterer Zielproteine Der Rezeptor bleibt aktiv solange ein Signalmolekül gebunden ist. Aktivierung von Zielmolekülen Inaktivierung der G-Proteine • Schnelle Inaktivierung durch GTPase Aktivität der α-Untereinheit (Hydrolyse von GTP zu GDP). • GTPase Aktivität erhöht durch Bindung an Zielprotein oder an einen Modulator RGS (regulator of G protein signaling). Diversität G-Protein gekoppelter Signalwege Ca. 60% aller Medikamente wirken auf die Signal-übertragungswege der G-Proteine. C) Enzymgekoppelte Rezeptoren Bindung von Wachstumsfaktoren sehr geringer Konzentration (nM - pM). Signalantwort in der Regel langsam (Stunden) und über mehrere Schritte. Einteilung in sechs Klassen: Rezeptor Tyrosinkinasen (RTK): Phosphorylieren Tyrosine von spezifischen intrazellulären Signalproteinen. Tyrosinkinase assoziierte Rezeptoren: Assoziieren mit intrazellulären Proteinen, die Tyrosinkinase Aktivität besitzen. Rezeptorähnliche Tyrosinphosphatasen: Entfernen Phosphatgruppen von Tyrosinresten an spezifischen intrazellulären Signalproteinen. Rezeptor Serin/Threoninkinasen: Phosphorylieren spezifische Ser oder Thr von assoziierten Genregulationsproteinen. Rezeptor Guanylyl Cyclasen: Katalysieren direkt die Produktion von cGMP im Cytosol. Histinkinase assoziierte Rezeptoren: Aktivieren einen “zwei Komponenten” Signalweg, bei dem die Kinase sich selbst phosphoryliert and dann dieses Phosphat sofort auf ein sekundäres Signalprotein übertragen wird. Rezeptor-Tyrosinkinasen: Subfamilien Transmembranproteine: extrazellulärer Ligandbindungsstelle eine Transmembranhelix cytosolischer Domäne mit Enzymaktivität oder direkt assoziiert mit Enzym. Klassifizierung in verschiedene Subfamilien. Rezeptor-Tyrosinkinasen: Aktivierung Katalysieren die Übertragung einer Phosphat-Gruppe von ATP auf spezifische Tyrosinreste im Rezeptormolekül (Autophosphorylierung) oder in assoziierten intrazellulären Substratproteinen. Beispiele für Rezeptor “Crosslinking” A. Platelet-derived growth factor (PDGF): Kovalent verbundenes Dimer mit zwei Rezeptor-Bindungsstellen. B. Fibroblast growth factors (FGFs): Monomer, bindet in Klustern an Proteoglykane und kann darüber Rezeptor vernetzen. C. Ephrin: Monomer, membrangebunden, Vernetzung durch Kluster in der Zellmembran. Phosphorylierungskaskade Signaltransduktion Signalübertragungsweg / Signaltransduktionsweg =Prozess, durch den Signal an Zelloberfläche in spezifische Zellantwort umgesetzt wird, besteht aus mehreren Schritten. Derartige Mechanismen entwickelten sich vermutlich bereits bei den Urformen der Pro- und Eukaryoten und wurden bei den viel später entstandenen vielzelligen Organismen für neue Funktionen abgewandelt. Unsere heutigen Kenntnisse gehen auf die Pionierarbeiten von Earl W. Sutherland zurück, der 1971 den Nobelpreis erhielt: ”for his discoveries concerning the mechanisms of the action of hormones.” Sutherland untersuchte, wie Adrenalin in Leber- und Skelettmuskelzellen den Abbau von Glykogen anregt. Earl W. Jr. Sutherland (1915-1974) Sekundäre Botenstoffe Nicht alle Komponenten eines Signalweges sind Proteine. Sekundäre Botenstoffe (Second Messenger) = kleine, wasserlösliche Moleküle oder Ionen. (Primärer Botenstoff = von außen kommendes Signal.) Leichte Ausbreitung durch Diffusion ermöglicht die Vermittlung des Signals z.B. von der Zellmembran ins Zellinnere. Die häufigsten Sekundären Botenstoffe sind: zyklisches AMP (cAMP) Calciumionen (Ca2+) Diacylglycerin (DAG) Inositoltriphosphat (IP3) Bildung von cAMP durch Adenylatcyclase cAMP spielt bei vielen G-Protein vermittelten Signalwegen eine Rolle. cAMP Aufbau durch Adenylatcyclase cAMP Abbau durch Phosphodiesterase Stimulatorische u. Inhibitorische G-Proteine Stimulatorische G-Proteine (Gs): aktivieren Adenylat-Cyclase Inhibitorische G-Proteine (Gi): inhibieren Adenylat-Cyclase Cholera und Pertussis Cholera: BakteriumVibrio cholerae Cholera Toxin ist ein Enzym, das ADPRibose von NAD+ auf die αUntereinheit eines Gs-Proteins überträgt. Dies verhindert die Hydrolyse von gebundenem GTP (G-Protein immer ‘an’). Aktiviertes G-Protein stimuliert die Adenylat-Cyclase, erhöht cAMP Konzentration. Erhöhter cAMP Spiegel in den Epithelzellen des Darms bewirkt starken Einstrom von Cl– und Wasser in den Darm, was starken Durchfall auslöst. Cholera und Pertussis Pertussis (Keuchhusten): Bakterium Bordetella pertussis Pertussis Toxin katalysiert die Übertragung von ADP-Ribose auf die α-Untereinheit eines Gi-Proteins. Dies verhindert die Interaktion der α-Untereinheit mit dem Rezeptor, so dass GDP nicht durch GTP ausgetauscht werden kann (G-Protein immer ‘aus’). cAMP abhängige Proteinkinase (PKA) cAMP abhängige Proteinkinase (PKA) ist ein Komplex aus zwei katalytischen und zwei regulatorischen Untereinheiten. 1. cAMP aktiviert katalytische Untereinheit 2. katalytische Untereinheit wandert in Kern, aktiviert CREB (=CRE-binding protein). 3. CREB bindet an CRE (cAMP responsive element), aktiviert Gentranskription. Signalkaskaden verstärken das Signal Beispiel: Glykogenabbau Phopholipase C bildet zwei sekundäre Botenstoffe (DAG, IP3) DAG IP3 Wirkungsweise von IP3 IP3 diffundiert von der Membran durch das Cytosol zum ER und öffnet Ca2+-Kanäle. Ca2+ als intrazellulärer Botenstoff Wirkung von Ca2+ durch großen Konzentrationsunterschied (10 000-fach) zwischen extrazellulärer Flüssigkeit und Cytosol ermöglicht. Calmodulin (CaM) bindet Ca2+ Wichtigstes Ca2+ bindendes Protein. Vier hochaffine Ca2+ Bindungsstellen (EF-Hand-Bindungsmotiv). Allosterische Konformationsänderung nach Bindung von ≥ 2 Ca2+. 4 Ca2+ Ca2+-Bindungsstelle: 12 AS lange Schleife mit Asp und Glu. • Ca2+/CaM erkennt positiv geladene amphipatische a-Helices. • Ca2+/CaM kann Ca2+-Pumpe aktivieren, die Ca2+ aus der Zelle pumpt. • Ca2+/CaM wirkt jedoch meist über Ca2+/CaM-abhängige Proteinkinasen. Ca2+ als intrazellulärer Botenstoff Beispiele: Ca2+ Welle nach Befruchtung einer Eizelle startet embryonale Entwicklung. Ca2+ bewirkt Kontraktion von Muskelzellen. Ca2+ bewirkt Sekretion in vielen sekretorischen Zellen, inklusive Nervenzellen. Regulation of liver glucose metabolism by hormones Catecho lamines Insulin Catecho lamines Glucagon GLUT Gs PKB GSK-3 IRS1 PI3K Gq PLC PDK cAMP PKC Glucose Glucose cAMP PKA Glukokinase Ca Ca PP2A Glucose6-phosphate ATP ADP P Glycogen synthase P P Glycogen phosphorylase a Glycogen phosphorylase b Glycogen Fructose1, 6-bisphosphate H2 O Glucose6-phosphate P mTOR CamK AMPK P PP2A FOXO1 FOXO1 P Phosphoenolopyruvate GDP, CO2 PEPCK ChREBP ChREBP Xylulose 5-phosphate PKB Fructose2,6-bisphosphate P P GTP cAMP P PKA mTORc2 Oxaloacetate P Pyruvate kinase Pyruvate kinase mRNA ATP-citrate Lyase AAAAA ChREBPMlx Mlx ChREBP Pyruvate AAAAA CREB Glucococorticoids MKP-3 GR GR PGC-1 HNF FXR PGC-1 mRNA PPAR ATP Pi Glycogen Phosphofructokinase P Phosphoenolopyruvate Glucose-6phosphatase P PFK-2 FBPase-2 P AMPKK (LKB1) ADP cAMP PKA PKC ATP ADP GLUT AC P Glucose-6-phosphatase PEPCK mRNAs AAAAA FOXO1 CREB P Citrate ADP ATP Effektuierung – wie ändert ein Signal die Zellantwort Kovalente Proteinmodifikationen Nicht-kovalente Proteinmodifikationen Abbau von Proteinen 1. Signal 2. Erkennung 3. Übersetzung 4. Effektuierung De novo Synthese von Proteinen Zwei Hauptwege der Signalübertragung - kovalente Proteinmodifikation G-Protein gekoppelte Rezeptoren Signalübertragung durch G-Proteine Enzymgekoppelte Rezeptoren Signalübertragung durch Phosporylierung Ca2+/CaM-abhängige Kinasen (CaM Kinasen) - nicht-kovalente Proteinmodifikation CaM zeigt ‘ Klappmesser ’ -ähnliche Konformationsänderung bei Bindung der Substrathelix. • CaM Kinasen phosphorylieren Serine und Threonine in Proteinen (wie PKA, PKC). • Beispiele: Myosin-leichte-Ketten-Kinase aktiviert Muskelkontraktion, Phophorylase Kinase aktiviert Glykogenabbau. Regulation durch gerichteten Proteinabbau Proteasom-vermittelter Proteinabbau Ub Ub E1 Substrate Ub Ub Ub E3 E2 Ub Ub Ub ATP Ub Ub Ub E3 E2 E1 Ub Ub Ub Peptidases Ub Regulation des IKK Komplexes – Regulation durch Proteolyse TCR S1P Y90 T184 PKC P IRAK P 1 P T187 TAK1 S209 S657 E3 Y185 TAK1 P TAB1 S166 Ub Ub MEKK3S337 Ub Ub Ub Ub K63 Ub K63 LUBAC NEMO NEMO M1 Ub Ub Ub Ub Ub K48 Ub E2 TRAF6 Ub E3 K63 Ub S181 IKK S177 IKKS180 S32 S36 XIAP TAK1 Ub Ub RIP PIDD S181 S181 NEMO NEMO IKK S177 NEMO NEMO cIAP1 Ub K63 Ub K63 Ub Ub Ub Ub K63 IKKS180 IB Ub Ub Ub Ubc13 T183 S32 S36 Ub Ub CBMMalt1 E2 TRAF6 P TAK1 Ub P Ub E3 TAB1 UbS526 Ub MEKK3 Ub Ub JNK2 Bcl10 E2 T117 Ub CARMA1 P TAB2 Ubc13 MKK7 S109 S564 DNA damage Kinase kinase RIP SphK1TAB2 P PKCε TRAF2 Ubc13 DDR IL-1R T538 NFkBNFkB p65 p50 IB NFkBNFkB p50 p65 IKK S177 IKKS180 S1981 ATM S85 kinase TNF Ub NEMO NEMO IKK IKK S181 S177 IMMUNOLOGIE = Wie überlebt der Organismus den Kontakt mit potentiellen Pathogenen. Wie unterscheidet der Organismus selbst von nicht-selbst? Macrophage Engulfing Bacteria A macrophage, in yellow, engulfs and consumes bacteria. Macrophages are large phagocytes, cells that wander through the body consuming foreign particles such as dust, asbestos particles, and bacteria. They help protect the body against infection. Die Eindringlinge. . . Bakterien http://www.hhs.gov/asphep/presentation/images/bacteria.jpg Viren Parasiten Pilze, Protista, & Würmer http://www.skidmore.edu/academics/biology/plant_bio/lab13.FUNGI.html worm trichura.jpg Zelluläre Immunologie Spezialfall der Signaltransduktion Potentielle Pathogene müssen erkannt werden Diese Erkennung muss in eine sinnvolle Antwort transduziert werden Mechanismen zur Pathogenabwehr werden initiiert Pathogene Hilfe holen (Cytokinexpression) Selbsthilfe (Antimikrobielle Peptide) Antimikrobielle Peptide sind kleine Peptide, die mit Membranen von Bakterien/Pilzen interagieren Antimikrobielle Peptide sind kleine Peptide, die mit Membranen von Bakterien/Pilzen interagieren - Ziel ist die Zerstörung des Membranpotenzials Infektiöses-Nichtselbst Modell – vorgeschlagen von Charly Janeway 1988 “Detection of conserved molecular patterns (pathogen- associated molecular patterns, PAMPs) by pattern recognition receptors (PRR)” Was sind PAMPs? Invariante Bestandteile von Bakterien LPS Peptidoglycan Flagellin Etc. Lipopolysaccharid (LPS) Peptidoglykane von Gram-positiven und – negativen Bakterien Gram-positive Gram-negative Nuesslein-Vollhard: Drosophila Toll Determiniert dorso-ventral Achse 1985 1988 1989 1991 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Toll: Molekulare Struktur IL-1R Toll (will become TLRs) Ig-like domain LRRs Box 1 Box 2 Box 3 TIR Domain Toll receptor has an extracellular region which contains leucine rich repeats motifs (LRRs) Toll receptor has a cytoplasmic tail which contains a Toll interleukin-1 (IL-1) receptor (TIR) domain Fliegen benötigen Toll um sich gegen Pilzinfektionen zu wehren Infected Tl-deficient adult flies with Aspergillus fumigatus All flies died after 2-3 days Flies use Toll to defend from fungi Thus, in Drosophila, Toll seems to be involved in embryonic development and adult immunity 1985 1988 1989 1991 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Überlebensrate adulter Drosophila, die mit Aspergillus fumigatus infiziert wurden WT vs Tl100 % survival 80 60 wild type Tl- 40 20 0 0 1 2 3 4 Time (days) 5 6 LPS TLR4 MyD88-Dependent Signaling Cell membrane sCD14 IRAK4 MEKK3 IRAK1 IRAK2 MKK3 MKK7 UBC13 TRAF6 TAB2 TAK1 p38 IKK- TAB1 UBV1A IKK- MAL MyD88 TOLLIP IKK- MD-2 LBP (-) TLR4 MD-2 LPS Proteasome JNK IB IB p50 NFB p65 TNF COX2 IL-18 Paz S., Nakhaei P,( 2005) NF-kB Faktoren translozieren in den Kern nach einer Infektion
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