Original Article（Clinical haemophilia ）‒ Full Translation HLA クラス II 対立遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの in silico 計算 による親和性は，F8 遺伝子にミスセンス変異を有する血友病 A 患者の インヒビター発生を予測する In silico calculated affinity of FVIII- derived peptides for HLA class II alleles predicts inhibitor development in haemophilia A patients with missense mutations in the F8 gene A. D. Pashov, T. Calvez, L. Gilardin, B. Maillère, Y. Repessé, J. Oldenburg, A. Pavlova and S. V. Kaveri and S. Lacroix-Desmazes on behalf of Abirisk Consortium Centre de recherche des Cordeliers, INSERM, UMR S 872; Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie CurieParis6, UMR S 872; Centre de Recherche des Cordeliers, Université Paris Descartes, UMR S 872, Paris, France; Department of Immunology, Institute of Microbiology, BAS Sofia, Bulgaria; Inserm et UPMC, UMR S 943, Paris; CEA, iBiTecS, Service d’ Ingé nierie Molé culaire des Proté ines, Labex LERMIT et VRI, Gif Sur Yvette; Laboratoire d’ hé matologie, CHU de Caen, Caen, France; Institute of Experimental Haematology and Transfusion Medicine, University Clinic Bonn, Bonn, Germany; and International Associated Laboratory IMPACT ( INSERM, France– Indian Council of Medical Research, India) , National Institute of Immunohaematology, Mumbai, India 要約：血友病 A（ HA ）患者の 40% が F8 遺伝子に 来ペプチドの HLA クラス II に対する親和性が，イ ミスセンス変異を持つ。しかしながら，同一変異患 ンヒビター発生と関連付けられるかについて検討 者のすべてが同様の第 VIII 因子（ FVIII ）インヒビ した。ミスセンス変異が報告された 1456 例と対応 ター発生リスクに曝されてはいない。重症 HA 患者 す る， 主 な 野 生 型 FVIII 由 来 ペ プ チ ド の HLA ク において，ヒト白血球抗原（ HLA ）ハプロタイプが， ラス II 対立遺伝子 10 種類に対する親和性につい FVIII インヒビター発生の危険因子として同定され た。我々は，内因性 FVIII にミスセンス変異を生じ ると，HLA クラス II に対する変異ペプチドの親和 性が変化することにより，FVIII 特異的 T 細胞寛容 を歪め，補充療法中，対応する野生型 FVIII 由来ペ プチドによる抗 FVIII 免疫応答の誘導リスクが上昇 するという仮説を立てた。本稿では，Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource データベー ス収載のミスセンス変異に対応する野生型 FVIII 由 て，平均値を予測した。線形回帰分析により，予 Correspondence: Sé bastien Lacroix- Desmazes, INSERM UMRS 872, Team 16, Centre de recherche des Cordeliers, 15 rue de l’Ecole de Médecine, F-75006 Paris, France. Tel.: +33 1 44 27 82 02; fax: +33 1 44 27 81 94; e-mail: [email protected] Haemophilia (2014), 20, 176–184 © 2013 John Wiley & Sons Ltd 4 測されるペプチド親和性の平均値と，変異インヒ ビターの状況との間に有意な関連が確認された（ P ＝ 0.006 ）。FVIII ドメインの変異部位調整後には， 有意差が消失した。A1-A2-A3-C1 ドメインの解析 では，予測される HLA 結合親和性とインヒビター の状況との間に正の相関が認められたが（ 三分位 値の低親和性については，OR ＝ 0.29［ 95% CI： 0.14 ∼ 0.60 ］，P ＝ 0.002 ），C2 ドメインに限定し た解析では逆相関が示された（ OR ＝ 3.56［ 95% CI：1.10 ∼ 11.52 ］，P ＝ 0.03 ）。FVIII ペプチドの ミスセンス変異患者の HLA 対立遺伝子への親和性 が FVIII 製剤の免疫原性に重要な役割を果たしてい ることを本研究データは立証するものである。 Key words：第 VIII 因子，免疫原性，MHC クラス II，ミスセンス変異，予測，T 細胞エピトープ HLA クラス II 対立遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの insilico 計算による親和性は，F8 遺伝子にミスセンス変異を有する血友病 A 患者のインヒビター発生を予測する 性の抗 FVIII IgG（ 5，6 ）および FVIII 反応性 T 細胞（ 7–9 ） 緒 言 が循環しても，中和抗イディオタイプ抗体（ 10，11 ） 血友病 A（ HA ）は，凝固因子である第 VIII 因子 および制御性 T 細胞（ 12 ）により制御される（ 関連レ （ FVIII ）をコードする遺伝子の変異に起因する，稀 ビュー（ 13 ））。従って，「 後天性血友病 」と呼ばれる な X 連鎖劣性遺伝性の出血性疾患である。HA 患 非血友病患者における病原性の抗 FVIII 免疫応答 者は FVIII 活性（ FVIII:C ）値の残存レベルに基づ は極めて稀な事象であり，発生例は毎年 100 万人 き，その血漿と正常な血漿との比較により識別され 当たり 5 人にも達しない（ 14 ）。一方，CRM 陰性 HA る（ 1 ）。即ち，重症表現型を呈する患者の FVIII:C は 患者の免疫系は，FVIII に対する教育を受けていな 検出不能レベル（＜ 1% ）であるのに対し，中等症お い。そのため，抗イディオタイプ B 細胞のクロー よび軽症の HA 患者の場合，残存する血漿 FVIII:C ンおよび制御性 T 細胞は産生されないと考えられ， はそれぞれ 1 ∼ 5% （注：欄外参照） ， 5 ∼ 40% である。 患者が治療用 FVIII に対し同種免疫をもつリスクは 重症 HA 患者のうち，交差反応性物質（ CRM ）陽性 高く，そのリスクは経験的に 15 ∼ 50% の間であ である患者群では循環血中に変異 FVIII 分子がみら ると推測されている（ 15 ）。興味深いことに，HA 患 れる一方，CRM 陰性である患者群では変異分子が 者の約 40% に相当する（ 16 ）ミスセンス変異を有す みられないという事実は，HA 患者集団の不均一性 る CRM 陽性患者は，中間的状況に当たり，その免 をより一層増大させている。こうした表現型の不均 疫系は「 ほぼ正常 」な FVIII に対する教育を受けて 一性は，FVIII の不活化をもたらす多種多様な遺伝 いる。治療用の野生型 FVIII が投与されると，議論 子異常に起因している。これには，大小の欠失，ナ の的となっているハプロタイプの差を例外とすれ ンセンス変異を生じる一塩基置換，スプライス部位 ば（ 17，18 ），ミスセンス変異を担う内因性 FVIII のペ のミスセンス変異または変化，イントロン 1 または プチドが FVIII 製剤分子のペプチドに対応していれ イントロン 22 の逆位，ヌクレオチドの欠失／挿入 ば，制御性抗体および制御性 T 細胞に直面しない。 （2） などが挙げられる 。 FVIII 製 剤 補 充 療 法 は，HA 患 者 の 出 血 性 エ ピ ソードを抑制する治療選択肢である。残念ながら， HA 症例の 5 ∼ 40% において，FVIII 注射製剤に 対 し，IgG ア イ ソ タ イ プ で あ る 抗 FVIII 抗 体（ イ 従って，CRM 陽性患者は，FVIII 製剤に対し部分 的に寛容であり，FVIII インヒビター発生リスクが 低く，5 ∼ 10% の範囲であると報告されている。 遺伝と環境の両方からなる複数の危険因子は， り，生活の質を悪化させ，治療費の大幅な増加をも FVIII インヒビターの発生と関連している。遺伝 的 危 険 因 子 に は，HA の 重 症 度， よ り 具 体 的 に は FVIII 障害の原因となる遺伝子異常型（ 19 ）が挙 げられ，また可能性として患者の内因性 FVIII と 治療用の外因性 FVIII 分子とのハプロタイプミス たらす（ 4 ）。 マッチ（ 17，18 ），免疫応答の制御に関与する遺伝子（ す ンヒビター）を産生する同種免疫応答が発生する。 そのため本治療は困難をきたす（ 3 ）。FVIII インヒ ビターの発生により，患者の臨床管理は困難にな 個体の免疫系が FVIII を判断する方法は，内因性 なわち，TNFα，IL-10，CTLA-4 ）プロモーター多 の FVIII 分子の存在自体および性質により指示され 型の存在（ 20–23 ），ヒト白血球抗原（ HLA ）系の一部 る。従って T 細胞および B 細胞が個体発生過程で の主要組織適合遺伝子複合体（ MHC ）クラス II ハ それぞれ胸腺，骨髄で受ける教育によって指示され プロタイプ（ 23–26 ）などがある。 ることとなる。健康な個体の場合，FVIII は免疫系 ミスセンス変異患者の場合，一部のミスセンス に提示され， 免疫系によって認識される。その結果， 変異は，インヒビター発生について他のミスセン 一部の非血友病個体では，自然抗体である自己反応 ス変異と比較した場合，4 倍の高リスクと関連付け られている（ 16，27 ）。しかしながら，補充療法後，同 注 ）原著では 2 ∼ 5％となっていますが以下の資料をもとに変更しました。 ・インヒビターのない血友病患者に対するガイドライン（ 2013 年改訂版） ・インヒビター保有先天性血友病患者に対するガイドライン（ 2013 年改訂版） じような変異を有する患者のすべてが FVIII インヒ ビターを発生するわけではない。例えば，Eckhardt 5 Full Translation: A. D. Pashov, et al. ら に よ る 研 究 は，Arg593Cys 変 異 患 者 52 例 中 8 （ 27 ） 例がインヒビターを発生することを見出した 。 スコドン生成例を除去した（ 585 例 ）。抗原発現確 認例（ すなわち，FVIII:Ag および／または FVIII:C 興 味 深 い こ と に，HLA-DRB1*01，DRB1*11， が 陽 性，1129 例 ）を 解 析 対 象 と し て 保 持 し た。 DRB1*15 など特定の HLA クラス II ハプロタイプ インヒビターの状況と FVIII 変異との関連の有無に が，同様のミスセンス変異を共有するインヒビター ついて，「 いいえ」と「 はい 」以外の回答例を除去し （ 28 ） 陽性患者コホートに高頻度に認められている 。 た（ 571 例 ）。サイレント変異例を除去した（ 3 例 ）。 総合すると，こうした知見から，患者の MHC クラ B ドメイン変異例を除去した（ 3 例―インヒビター ス II 分子と，外因性の治療用 FVIII 由来ペプチド との関連性がないため） 。こうして得られた計 1456 との結合親和性の重要性が指摘される。本研究で 例は，FVIII 分子の各種変異 500 例，変異部位の は，in silico 予測により，HLA クラス II 対立遺伝 差異 383 例であるとみなした（ Table 2 ）。変異の約 子に対する治療用 FVIII 由来ペプチドの親和性が， 64%（ 321 ／ 500 ）は単独例，30%（ 149 ／ 500 ）は 2 ∼ ミスセンス変異をもつ HA 患者の FVIII インヒビ ター発生と関連付けられるかどうかについて検討 した。 方 法 血友病 A に関連する FVIII 変異の HAMSTeRS データベース Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource（ HAMSTeRS ）は，HA の原因となる遺伝 子異常のパブリックドメイン中最大のリポジトリ （ 29 ） 。今回の解析実施時 である（ http://hadb.org.uk/ ） 点では計 3783 例が登録され，3747 例が FVIII 塩基 。 配列のエクソンにおける点変異であった （ Table 1 ） 解析例を以下の手順でさらに絞りこんだ。ナンセン 6 HLA クラス II 対立遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの insilico 計算による親和性は，F8 遺伝子にミスセンス変異を有する血友病 A 患者のインヒビター発生を予測する 10 例，6%（ 30 ／ 500 ）は 10 例以上である。最も 代表的な変異は R593C（ 75 例），R2150H（ 50 例 ）， R2159C（ 40 例 ），R531C（ 34 例）であった。一部 の解析では，重症度（ 重症／中等症／軽症 HA ）の 情報が入手できなかった 115 例を除き，変異例を 重症度によりさらに 3 クラスに細分した。 野生型 FVIII の塩基配列 野 生 型 ヒ ト FVIII の 塩 基 配 列 は， 複 数 の ウ ェ ブ サ イ ト（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ AAA52484. 1， http: / / www. uniprot. org/ uniprot/ P00451 ）から FASTA フォーマットで入手可能で ある。 る 15 アミノ酸長のペプチドに自動分割し 2337 本 とした。HLA クラス II 対立遺伝子のうち，欧州で 最も多くみられる対立遺伝子について，IEDB ウェ ブサイトに提示されている中から 10 種類（ HLA DR- B1* 0101， 0301， 0401， 0701， 0901， 1101， 1201，1301，1501，1502 ）を選択した。予測結果 を表にし，15 アミノ酸長のペプチドと 10 種類の HLA 対立遺伝子との各組み合わせを 1 行に記す （ Table 3 ）。従って，作業ファイルには，0 ∼ 100 の 範 囲 の 予 測 パ ー セ ン タ イ ル 順 位 が 23370 件 （ 2337×10 ）記載された。 統計解析 デ ー タ 解 析 対 象 は，3 ク ラ ス に お け る HA の IEDB Analysis Resource 「 Immune Epitope Database（ IEDB ） Analysis Resource 」ウェブサイトから，各種ペプチドと多 数の HLA クラス II 分子との結合状況が予測され る（ 30 ）。 本 サ イ ト で は，5 種 類 の ア ル ゴ リ ズ ム （ NN-align（ 31 ），SMM-align（ 32 ），コンビナトリアル ，ARB［ average relative ライブラリー［ CombLib ］ binding ］マ ト リ ッ ク ス（ 33 ），netMHCIIpan（ 34 ）， Sturniolo 法（ 35 ））と 1 種類のメタアルゴリズム（ コ 重 症 度，FVIII の 重 鎖（ B ド メ イ ン を 除 く ）ま た は 軽 鎖 の 変 異 部 位，FVIII ド メ イ ン（ A1-A2-A3- ス法は，3 種類以上の方法により結合が予測可能で C1-C2-a1-a2-a3 統合領域 ）の変異部位の 3 因子と した。最終的に，インヒビターの誘発（ Table 4 ） と，HAMSTeRS データベース登録患者毎の内因 性 FVIII 変異ペプチドに対応する，野生型外因性 FVIII ペプチドに予測される無差別性との相関につ いて検討することを目的とした。点変異毎に，15 アミノ酸長のフレーム 15 本に変化が生じる（ 例え ば，R593 に つ い て は Table 3 参 照 ）。 各 対 立 遺 伝 子については，影響を受ける 15 アミノ酸長のペプ ある場合，いつでも適用される。コンセンサス法 チド中最も可能性が高い（ パーセンタイル順位が は，パブリックドメインで入手可能な他の方法に比 最小の ）エピトープのみを考慮した。免疫原性は， べ，無差別の MHC クラス II エピトープの検出に 10 種類の対立遺伝子のパーセンタイル順位最小値 ンセンサス法（ 36 ））が提供されている。コンセンサ （ 37 ） 優れた結果を示すことが報告されている 。対立 遺伝子によっては，コンセンサス法の予測因子の一 から平均値を採ることで予測した。この統合尺度 を「 結合スコア 」と呼ぶ（ Table 3 ）。「 結合スコア 」 部を入手不能であることから，コンセンサス法は は，あるペプチドと 10 種類の HLA-DR 対立遺伝 適用できない。今回の例では，IEDB の推奨方針に 子の予測親和性の平均値を表すものである。その より，次の効率順で利用可能な方法から選択する。 ため，ペプチドに対する「 結合無差別性（ binding コ ン セ ン サ ス 法 ＞ NetMHCIIpan ＞ NN-align ＞ promiscuity ）」と呼ばれることもある。 Stata ソフトウェア（ version 12, StataCorp LP 社 , 米国 , テキサス州 College Station ）を用いてロジス ティック回帰分析を実施した。HAMSTeRS データ SMM-align ＞ CombLib。すなわち，本研究では，個々 の対象対立遺伝子について IEDB 推奨法を使用す 「パーセンタイル順位」 る。結果は 0 ∼ 100 の範囲の に置き換えられ，0 の場合には所定の HLA 対立遺 伝子との結合親和性が高く，100 の場合には結合親 和性が低いことを表す。 FVIII 分子の全配列（ 2351 アミノ酸 ）を，隣接す ベースの情報例は統計単位で表し，従属変数はイ ンヒビターの状況とした。また独立変数は，HA の ，変異部位（ ポリペプチド鎖およ 重症度（ 3 クラス） びドメイン ） ，「 結合スコア 」 （ 本ソフトウェアによ 7 Full Translation: A. D. Pashov, et al. り自動的に三分位に分割 ）とした。本研究は，2011 年 10 ∼ 11 月に利用可能であった HAMSTeRS デー タベースを用いて実施した。本研究のため，最新の データベース（ 2012 年 12 月 ）を用いて再度分析を 実施し，両解析結果とも同一の結果が得られた。 結 果 FVIII 分子のミスセンス変異の分布 最初に点変異患者を HAMSTeRS データベース でスクリーニングした。コード配列のミスセンス変 異が，FVIII:Ag および FVIII:C の検出と関連付け ，ならびに患者にインヒ られる例（ CRM 陽性患者） ビター発生が報告されている例を選択した（ Table 1 ）。今回の選択基準では，FVIII の A1a1A2a2 およ び a3C1C2 ドメインのミスセンス変異を有した適格 例を 1456 例同定した。このうち FVIII のアミノ酸 変異部位が 383 例，異なるアミノ酸への置換が 500 例を占めた（ Table 2 ）。これは FVIII 分子の 907 ア ミノ酸長の B ドメインにおいて少数報告されてい るミスセンス変異について，B ドメインは FVIII 活 性に役割を果たさないという事実を示している。そ のため，B ドメインは解析対象としなかった。既報（ 2 ） では，F8 遺伝子点変異の約半分（ 53% ）が，FVIII 分子の重鎖によるものである。今回の選択基準を用 8 HLA クラス II 対立遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの insilico 計算による親和性は，F8 遺伝子にミスセンス変異を有する血友病 A 患者のインヒビター発生を予測する いたところ，F8 遺伝子ミスセンス変異が，A1 およ 結合スコアは，HAMSTeRS データベースに報告さ び A2 ドメインに同様の割合（ 54% ）で認められた。 れた，ミスセンス変異に対応する野生型ペプチド毎 各ドメイン長の補正後では，今回選択したミスセン に作成した。予測される親和性の平均値，すなわち ス変異の発生範囲は，A1，A2，A3 ドメイン（ 30.0 10 種類の HLA-DR 対立遺伝子に対する無差別性を ± 1.6% ）の方が C1，C2 ドメイン（ 22.9 ± 3.0% ）よ 表す各ペプチドの結合スコアを用いて，次に対応す 。 りも大きかった（ P ＝ 0.038 ） る変異について，HAMSTeRS に報告されていると おり，インヒビター陽性か陰性のいずれかの状況と HAMSTeRS データベースにおけるインヒビター の存在と関連付けられる因子 ミスセンス変異患者の 6.52% においてインヒビ ターの存在が報告された（ 95% CI：5.31 ∼ 7.92% ） 。ミスセンス変異患者間の HA の重症度 （ Table 4 ） は，インヒビターの存在と有意な関連を示さなかっ た（ P ＝ 0.163 ）のに対して，インヒビター発生頻 度は各ドメインの変異部位と統計的に有意な関連 ， A2［ 7.79% ］，A3［ 4.71% ］， を示した（ A1［ 2.02% ］ a1a2a3［ 0.89% ］，C1［ 10.33% ］，C2［ 12% ］，P ＜ 0.001 ） 。しかしながら，FVIII の軽鎖，重鎖の変 異部位とは関連を示さなかった（ P ＝ 0.087 ）。 関連付けた。 各ペプチドと 10 種類の HLA クラス II 対立遺伝 子との結合スコアは，インヒビターの存在と有意な 関連を示した（ Table 5 ）。すなわち，結合スコアの 平均値は，インヒビター陰性例の場合 10.01（ 9.54 ∼ 10.48 ），インヒビター陽性例の場合 7.36（ 6.32 ∼ 8.40 ）であった（ P ＝ 0.002 ）。ここで注目すべきは， この有意な関連性が HA の重症度の調整後（ P ＝ 0.002 ），および HA を引き起こすミスセンス変異 を担う FVIII ポリペプチド鎖の調整後（ P ＝ 0.004 ） とも持続したことである。これに対し，ミスセン ス変異を担う性質がある FVIII ドメインの調整後に は，有意な関連性が消失した。 予測結合スコアとインヒビターの存在との 関連性 HAMSTeRS データベースから選択された変異ペ プチドに対応する野生型 FVIII ペプチドについて， それぞれ結合スコアを予測した。R593 における一 例 を Table 3 に 示 す。R593 を 網 羅 す る 15 ア ミ ノ 酸長の各ペプチドについて，解析対象の 10 種類の HLA-DR 対立遺伝子毎に IEDB を用いてパーセンタ イル順位を予測し，15×10 のマトリックスを作成し た。HLA-DR 毎に，15 アミノ酸長 15 本のペプチド 。 のパーセンタイル順位最小値を選択した （ Table 3 ） 次に，この 10 種類のパーセンタイル順位最小値 から，10 種類の HLA-DR 対立遺伝子の平均値を 算出した。これを「 結合スコア」と呼ぶ（ Table 3 ）。 次に，結合スコアを自動的に三分位に分割するこ とにより，カテゴリー変数に変換した。その結果は Table 5 と一致し，結合スコアが最小のペプチド（ 予 測される親和性の平均値が最も高いペプチド ）に変 異を認める場合，インヒビターの割合は有意に高 くなった（ P ＝ 0.006，Table 6 ）。重症度，個々の FVIII ドメインの部位，FVIII の重鎖／軽鎖の部位 によるインヒビターの割合について二変量解析を P 値はそれぞれ 0.168，＜ 0.001，0.086 行ったところ， であった（ Table 4 と一致 ） 。インヒビターの割合 と結合スコアとの関連性は，HA の重症度およびミ スセンス変異を担うポリペプチド鎖の調整後，多 変量解析においてなお統計的に有意であった（ P ＝ 0.0013 ）。これに対し，個々のドメイン調整後の多 9 Full Translation: A. D. Pashov, et al. 変量解析では，統計的有意性が消失した（ Table 6, P ＝ 0.113 ） 。よって，本解析におけるそれぞれの ドメインの重要性についてより詳細に検討した。 A1，A2，A3，C1 の統合ドメインの重要性と， C2 ドメインの重要性を分けて検討した。A1，A2， A3，C1 ドメインを解析したところ，変異ペプチ ドがインヒビター陽性である状況と，対応する野 生型 FVIII ペプチドの結合スコアとの間に，統計 的に有意な関連性が認められた（ Table 7，それぞ 。同様に，C2 ドメイン単独で解析す れ P ＝ 0.002 ） ると，予測結合スコアと，各ペプチドと関連付け られるインヒビターの状況との間に有意な関連性 。なお，C1 および A ファ が示された（ P ＝ 0.03 ） ミリードメインでは，この関連性については，イ ンヒビター関連変異に対応するペプチドに対し低 た。しかしながら，C2 ドメインの場合，結合スコ 結合スコア（ 予測される親和性の平均値が高値 ）で アとインヒビターの状況との OR は逆相関を示した あるという当初の仮説と一致した（ 予測される親和 （ 予測される親和性の平均値が低い［ 結合スコアの 性の平均値が低い［ 結合スコアの三分位が高い ］場 三分位が高い ］場合，OR ＝ 3.56［ 95%CI ＝ 1.10 ∼ 合，OR ＝ 0.29［ 95%CI ＝ 0.14 ∼ 0.60 ］）と な っ 11.52 ］）。この結果から，C2 ドメインの変異ペプ 10 HLA クラス II 対立遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの insilico 計算による親和性は，F8 遺伝子にミスセンス変異を有する血友病 A 患者のインヒビター発生を予測する チドに対応する野生型 FVIII ペプチドは，本解析対 解析とは異なり（ 2 ），本研究例のインヒビターの状 象の HLA-DR 対立遺伝子全セットとの結合親和性 況は HA の重症度と関連付けられないことが示さ が高くなく，無差別性を示す度合いが低いものであ れた。こうした結果が得られるのは，今回の解析対 ると示唆される。従って，FVIII 分子の残りのエピ 象患者が，血漿により測定される FVIII の残存活性 トープとは異なり，C2 ドメインの変異では，イン に関わりなく，すべて CRM 陽性であり，対象患者 ヒビター誘発リスクの最大化と，無差別性の低いエ の免疫系が，内因性の変異 FVIII に対する教育を受 ピトープの減少とが関連付けられた。 けているためだと考えられる。今回の解析は，本研 究例のインヒビターの状況が，FVIII 重鎖または軽 鎖の選択的な変異部位と関連付けられないことも 考 察 示している（ 2 ）。 今回のデータが示すとおり，ミスセンス変異をも 本研究の仮説どおり，今回の結果には，HLA に つ HA 患者においては，複数の HLA クラス II 対立 対する野生型 FVIII ペプチドの予測親和性の平均値 遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの予測親和性の （無差別性）と，解析対象の対応する各変異ペプチ 平均値は，FVIII インヒビターの発生と関連付けら ドに対するインヒビターの状況との間には，統計的 れる。FVIII 分子の大きさから，結合アッセイを用 に有意な関連が認められた。ここで注意すべきは， いて今回の in silico 予測を確認することは不可能で HAMSTeRS データベース収載の各患者の HLA ハ （ 38 ） 。ここで重要なのは，IEDB のコンセン プロタイプ自体は入手できないことである。そのた サス法の予測検出力の検証が実際の結合データに め，今回の方法では，公開されている野生型 FVIII 先立って実施され，所定の親和性の閾値に対する分 の塩基配列を用いて得られるペプチドを対象に， 類が行われていることである。この場合，親和性の 閾値 1 μM についてプロットした受信者動作特性曲 HLA クラス II 対立遺伝子に対する in silico 予測に よる親和性と，FVIII 変異およびインヒビターの状 線の曲線下面積は約 0.8 であった（ 36，39 ）。注目すべ 況に関する経験的な臨床データとを単に人為的に関 きは，in vitro において HLA 対立遺伝子との結合 連付けている。従って，今回得られた統計的に有意 を認めるすべてのペプチドが，in vivo において必 な関連性は，HA 患者が外因性 FVIII に寛容である あった （ 36 ） ずしも T 細胞応答を誘導しないことである 。 場合，ペプチドと HLA の相互作用とそれに伴う各 各ミスセンス変異が FVIII インヒビター発生リス 種 T 細胞の形成が重要な役割を果たしていることを クに及ぼす影響を具体的に研究するため，また HA 示すものである。今回の結果は，各個体の HLA ハ 患者における不完全長 FVIII 分子産生例，または T プロタイプに関し，野生型 FVIII 由来ペプチドによ 細胞個体発生中の胸腺における不完全長 FVIII 分子 るインヒビター発生に対し予測される親和性の平均 提示例と考えられる例を対象とすることにより，生 値（すなわち無差別性）の確定に道を開くものであ じ得る不均一性を最小化するため，完全長 FVIII が る。これにより，臨床試験では，CRM 陽性患者の 産生されないと関連付けられるミスセンス変異を 免疫系の状況，HA を引き起こすミスセンス変異， 本解析から除外した。よって，今回の解析では，収 HLA-DR ハプロタイプが同定され，対応する野生型 載例 1456 例に対応する，異なる型の変異 500 例に ペプチドの in silico 予測による親和性が適合する。 付随する異なる変異アミノ酸 383 例に焦点を当て こうした関連性は，これまでの研究でも in silico た（ Table 2 ）。重要なのは，こうした選択例を用い において示唆されてきたが（ 41，42 ），今回の研究では， た場合，FVIII 分子の様々なドメインにおけるミス 変異が位置付けられているドメインを多変量解析 センス変異の分布と，インヒビター関連の変異の分 により調整後，この統計的有意差が消失することを （ 19，40 ） の分布と本質的に類似することで 明らかにした。本稿の仮説どおり，A1，A2，A3， ある。さらに今回の解析からは，ミスセンス変異患 C1 ドメインの変異部位のみを対象にした解析では， 者集団においては，HA 患者集団全体を対象とする 変異ペプチドがインヒビター陽性である状況と，低 布が，既報 11 Full Translation: A. D. Pashov, et al. 結合スコア（ HLA クラス II に対応する野生型ペプ 少なくとも 1 つに対応することが認められている チドに予測される親和性の平均値が高値 ）との間に （ データは示されていない ） 。例えば，W2229C 変 統計的に有意な関連性を認めた。反対に，C2 ドメ 異は，2 種類の HLA-DR 対立遺伝子（ DRB1*0301， イン単独で変異部位の解析を行ったところ，変異ペ DRB1*1101 ）のみ高結合親和性を示すと予測され プチドがインヒビター陽性である状況は，HLA ク る領域に生じるが，インヒビター陽性である状況に ラス II 対立遺伝子に対し，野生型ペプチドの無差 関連付けられるのは対象例の 32% である。加えて， 別性のレベルが低い方が高頻度にみられることを 複 数 の「 高 リ ス ク 」F8 遺 伝 子 型 が FVIII の C2 ド 示した。 メインに位置付けられている（ W2229C，P2300L， にわたる親和性の平均値（ 結合スコア ）を分析し （ 18，45 ） N2286K ） 。しかしながら，C2 ドメインの疎 水性が FVIII 分子のそれ以外のドメインに比べ上昇 た結果，FVIII 分子における無差別または免疫優 している（ 46 ）ことが今回認められた差異の原因なの 性の T 細胞エピトープの存在が明らかとなった。 か，あるいは C2 ドメインがフォン・ヴィレブラン van Haren らは，本研究対象の対立遺伝子に一致 する HLA ハプロタイプを持つ健康供血者 4 名の 単球由来樹状細胞から，FVIII 由来ペプチドを分 離している（ 43 ）。同定されたペプチドは，FVIII 分 ド因子（ 47 ）または活性化膜のリン脂質に結合する際 今 回 10 種 類 の HLA ク ラ ス II 対 立 遺 伝 子 全 体 子のすべてのドメインから生じたものである。本 に果たす役割がそうであるのかは，未だ解明されて いないままである。 謝 辞 知見とは対照的に，Steinitz らによる最近の研究で 本研究は国立保健医学研究所（ INSERM ），フラ は，免疫優性のペプチドが，C2 ドメインを除くす ンス国立科学研究センター，ピエール・エ・マリー・ べての FVIII 分子のドメインに存在することが示さ キュリー大学（ パリ VI 大学 ），Partenariats Hubert （ 44 ） FVIII に関する免疫処置により抗 C2 抗体が生じて も，C2 ドメインのエピトープに反応する T 細胞ハ イブリドーマはみられなかった。C2 の変異ペプチ Curien（ Programme RILA 2011，25250XM ），フラ ンス国立研究機構（ ANR-07-MRAR-028-01 ）の支 援を受け，CSL-Behring S.A. 社（ フランス , パリ ） および助成契約番号（ 115303 ）の下で画期的新薬 構想合弁事業（ Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking ）から助成を受けた。助成内容は，欧 州連合第 7 次フレームワーク計画（ FP7 ／ 2007 ∼ 2013 年 ）からの出資，および EFPIA 加盟企業の同 ドに対応する野生型ペプチドと，残りのドメインの 種の出資からなるものである（ より詳細な情報につ 変異部位に対応する野生型ペプチドにより得られ 。LG は いては，www.abirisk.eu を参照されたい ） た今回の結果の不一致は，上記知見に一致するも INSERM（ フランス , パリ ）の客員研究員であった。 れている 。Steinitz らのグループは，A1，A2， B，A3，C1 ドメイン由来ペプチドに対し増殖す る FVIII 欠乏 E17 HLA-DRB1*1501 トランスジェ ニックマウスから，CD4 ＋ T 細胞ハイブリドーマ を作製することが出来たのである。しかしながら， のである。さらに，免疫原性を定義する複数の因 子は，FVIII 分子の様々なドメインに等しい影響を 及ぼさないことが示唆される。重要なことは，高 結合スコア（ 複数の対立遺伝子に対し予測される親 和性の平均値が低値 ）であっても，その野生型ペプ チドが，分離された一部の HLA 対立遺伝子の優れ 各著者の貢献度 ADP，TC，SVK，SLD は本研究をデザインし， 本稿を執筆した。ADP，TC，LG，YR，SLD は本 研究を実施した。ADP，TC，LG，BM，JO，AP， SLD は本データを解析した。 たエピトープでないという意味ではないことであ る。それどころか，C2 ドメインの変異部位はすべ て，きわめて低い結合スコア（ 特定の対立遺伝子に 対しきわめて高い親和性 ）をもつ野生型ペプチドの 12 開 示 著者らは，対立または偏りがあると認められる利 害関係がないことを表明している。 HLA クラス II 対立遺伝子に対する FVIII 由来ペプチドの insilico 計算による親和性は，F8 遺伝子にミスセンス変異を有する血友病 A 患者のインヒビター発生を予測する References 14 Collins PW, Hirsch S, Baglin TP et al. 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