１５酵素免疫測定法入門 ∼抗原・抗体反応の応用自然研究講座片桐昌直はじめに酵素免疫測定法は、EIA（Enzyme Immunoassay）あるいは、ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)とも呼ばれ、抗体の抗原に対する高い特異性と親和性を用い、種々の試料からの微量の抗原に対する検出・定量法です。従って、この酵素免疫測定法の理解には、抗原抗体反応の理解が不可欠です。一方では、この手法は現在 HIV や SARS などの抗体検出による疾患診断やガン関連抗原の検出、妊娠診断などの医療分野や遺伝子組換え作物の検出や食物アレルゲンの検出などの農学分野、さらには薬物検査などの警察分野など、幅広い分野で使用されています。従って、この分野の実習は、単に免疫分野の一部（液性免疫）を学ぶというのみならず、身の回りでの科学の理解にとっても重要な考え方を与えるものと考えられます。 n 抗体、酵素、抗原抗体反応抗体（イムノグロブリン G）の構造 VH と VL 部分の立体構造免疫グロブリンの基本構造 ①Fab 領域, ②Fc 領域, ③重鎖（N 端側から VH、CH1、ヒンジ部、CH2、 CH3）, ④軽鎖（N 端側から VL、CL）,⑤抗原結合部位, ⑥ ヒンジ部 n 抗原一般に、分子量５，０００以上の高分子が、抗原として認識され、抗体を生産します。つまり、抗原とは、抗体（イムノグロブリン）に結合するものです。 n 酵素免疫測定法に使われる酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ）ペルオキシダーゼ（Hydrogen peroxidase，Horseradish peroxidase，HRP）反応色原性基質＋H2O2 ⇔酸化型色素＋２H2O 起源西洋わさび（Horseradish）分子量，至適 pH 40,000， pH 6.5 基質特異性色原性基質（水素供与体）については、特異性はない．過酸化物としては H2O2, CH3OOH, C2H5OOH のみ阻害剤と活性化剤阻害剤：CN-，S--，F-，N3-（抗凝固剤として用いられるフッ素イオンと保存料として用いられる NaN3 に注意！）安定性（シバヤギ n 乾燥，冷蔵状態で数年間，水溶液で冷蔵 1 年間安定ホームページ http://www.shibayagi.co.jp/technology_002_01.html より）抗原抗体反応の性質抗原抗体反応、つまり抗原と抗体の結合は、右図の様に、共有結合以外の分子間に働くすべての相互作用を使って結合しています。従って、反応は、抗原・抗体の濃度以外にも、ｐＨ、イオン強度、温度、時間などに依存することになります。抗原・抗体反応に関係する相互作用今回は、バイオラド社の「ELISA イムノ Explor キット」（カタログ＃166−2400JEDU）を少し改編して実験を行って頂きます。実験は、抗体検出の実験で、用いられる抗体は、ウサギで作成した、ウサギ抗ニワトリγ−グロブリンポリクローナル抗体で、従って、抗原は、ニワトリγ−グロブリンというタンパク質です。γ−グロブリンとは、血清中のタンパク質を電気泳動により分画したときの分画名で、抗体（イムノグロブリン）が含まれています。ですので、今回の実験は、ニワトリの抗体をウサギの抗体と酵素で検出する実験です。臨床検査の場合は、ヒト血清中の特定の抗原に対する抗体（例えば、肝炎ウィルスに対する抗体）を、マウスのモノクローナル抗体を用いて検出しています。 ■ 実験酵素免疫測定法による、抗体の検出操作１．１次抗体（ウサギ抗ニワトリγ−グロブリン抗体）の希釈下図の様にして抗体の希釈系列を作ります。２００μL のリン酸緩衝液 pH7.4 をチューブに入れておき、原液から１００μL の溶液をｘ３のチューブに入れ、フタをして転倒混和します。その後、１００μL を取り、次のｘ９のチューブに入れ混ぜます。これを繰り返し、３倍希釈系列を８１倍まで作ります。 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml ｘ１（原液） 200 ml of リン酸緩衝液ｘ3 ｘ9 ｘ27 ｘ81 ２．１２ウェルストリップ２つに、下図の様に印をつけます。「＋」は陽性コントロール、「−」は陰性コントロールを示します。また、「未知」は未知資料を示します。ｘ1 ｘ1 ｘ1 ｘ３ｘ３ｘ９ｘ３ｘ９ｘ９ｘ27 ｘ27 ｘ27 ｘ81 ｘ81 ｘ81 未知未知未知３．マイクロピペットを用いて精製抗原（ニワトリγ−グロブリン）５０μL をストリップのウェル２４個全部に加えます。４．５分間放置して抗原がウェルに吸着するのを待ちます。５．洗浄します。 a.ストリップをペーパータオル上に上下逆に伏せて、逆さまのまま数回指先でたたき中の液体を取り除きます。 b.スポイドを用いて各ウェルに洗浄液を満たします c.ストリップ内の洗浄液をすべて捨てます。勢いよく液を捨てることがポイントです d.再度ペーパータオル上で中の洗浄液をすべて取り除きます。６．新しいピペット用チップを用いて陽性コントロール（＋）５０μL を（＋）印がついたウェル３個に加えます。７．新しいピペット用チップを用いて陰性コントロール（−）５０μL を（−）印がついたウェル３個に加えます。８．それぞれ新しいチップを用いて、各希釈抗体５０μL を該当するウェル各３個に加えます。また、未知試料を「未知」と書いたウェル３個に５０μL を加えます。９．５分間放置して血清中の抗体が、標的（抗原）に結合するのを待ちます。１０．前述の洗浄方法を繰り返して、抗原に結合していない抗体（１次抗体）をウェルから洗い流します。１１．新しいチップを用いてマイクロピペットで、２次抗体（酵素標識抗体）５０μL をストリップの２４個のウェルに加えます。１２．５分間放置して２次抗体が、標的（１次抗体）に結合するのを待ちます。１３．前述の洗浄方法を繰り返して、抗原に結合していない２次抗体をウェルから洗い流します。１４．新しいチップを用いてマイクロピペットで、酵素基質（TMB）５０μL をストリップの２４個のウェルに加えます。１５．５分間放置したのち、１ moL/L 塩酸５０μL を加え酵素反応を停止させます。１６．プレートリーダーで、４５０ nm の吸光度を測定します。コロナ吸光マイクロプレートリーダー MTP-310 １７．得られたデータから下記表を完成させてください。試料吸光度(a) (a)-(-)=(b) (b)/(+)*100=(c) X1(1) X3(0.3333) X9(0.1110) X27(0.0370 X81(0.00411) （-） 0 （+） 0 100 未知試料お渡しする方対数グラフに、横軸に希釈ｘ1∼ｘ81 までの抗体の濃度つまり（）内の数字、縦軸に（ｃ）の値を取ってプロット。未知試料の抗体の濃度、つまり希釈率を推定して見てください。この実験に用いたキットは、学校向けにアメリカで開発されたキットで、３０名が実験をおこなうことが出来るるようになっています。この実験を挟んで、酵素免疫測定法や抗体についての説明を行いたいと思います資料等は当日配布予定です。参考文献１）バイオ・ラド社対応ページ http://www.bio-rad.com/ja-jp/product/elisa-immuno-explorer-kit ２）シバヤギＥＬＩＳＡ解説ページ http://www.shibayagi.co.jp/technology_002_01.html ３）抗体物語井上浄, 坂本真一郎, 久保田俊之リバネス出版（２００５）４）抗体科学入門（改訂版）岡村和夫工学社（２００９）