KURENAI : Kyoto University Research Information Repository Title Author(s) Citation Issue Date URL Regulated expression of neurogenic basic helix-loop-helix transcription factors during differentiation of the immortalized neuronal progenitor cell line HC2S2 into neurons( Abstract_要 旨) Otsuka, Toshiyuki Kyoto University (京都大学) 1998-07-23 http://hdl.handle.net/2433/182245 Right Type Textversion Thesis or Dissertation none Kyoto University 氏 名 おお 大 つか 塚 士 とし 俊 ゆき 之 学 位 (専 攻 分 野 ) 博 学 位 記 番 号 医 学 位 授 与 の 日付 平 成 1 0年 7 月 23 日 学位 授 与 の要件 学 位 規 則 第 4 条 第 1項 該 当 研 究 科 ･専 攻 医 学 研 究 科 脳 統 御 医 科 学 系 専 攻 学位 論 文 題 目 Re g ul a t e de x pr e s s i onofne rog u e ni cba s i che l i xl oo phe l i xt r a ns c r i pt i onf a c t or s 博 ( 医 学) 2040 号 第 d ur i ngdi f f e r e nt i a t i onoft hei mmor t a l i z e dne u r ona lpr oge ni t o rc e l ll i neHC2S2 i nt one u r ons ( 神 経 前 駆 細 胞 不 死 化 細 胞 株 HC2 S2の神 経 分 化 にお け るba s i che l i xl oo p - he l i x型 転 写 因子 の発 現 制御 に関す る研 究 ) ( 主査) 論 文 調 査 委 員 教 授 野 田 論 亮 文 内 教 授 中 西 重 忠 容 の 要 教 授 橋 本 信 夫 旨 中枢神経 由来 の不死化細胞株 HC2S2の神経-の分化過程 にお ける各種 因子 の発現 を解析 し,神経分化 にお ける経時的 な遺伝子発現及びその制御 に関 して考察 した｡ HC2S2細胞 はテ トラサイ ク リンによ りⅤmycの発現が抑制 され る レ トロウイル スを用いて成熟 ラッ トの神経前駆細胞 を 不死化 した ものであるが,テ トラサイ ク リン投与 によ り神経特異的因子 の発現及び神経ネ ッ トワー ク形成 を伴 う神経最終分 化 を誘導す ることが可能である｡ この系 を用いて神経発生分化 に重要 なba s i che l i xl o o phe l i x( bHLH)型転写因子 の発現 を中心に解析 した｡ bHLH型転写因子 は細胞系譜 の決定や最終分化 において中心的役割 を担 ってい ることが次第 に解 明 されてきてい る｡近年 シ ョウジ ョウバェの神経発生 を制御 してい るbHLH型転写因子 の晴乳類 でのホモ ログがい くつか発見 され解析 されてい る｡ しか しなが ら,晴乳類 の中枢神経系 における神経前駆細胞 か ら成熟神経細胞-の最終分化過程 を制御す る分子機構 には不 明 な点が多い｡ 今 回No r t he n bl r o tに よ り発 現 を検討 した 9種 の神 経 特異 的bHLH型 転 写 因子 の うち, MASHl1, Ne ur o D, Ne ur o D- r e l at e df ac t o r( NDRF)及びHESl1mRNAの発現 がHC2S2細胞 の分化過程 を通 じて認 め られた｡ To t alRNAを用いた 2,ne ur og e ni n,HES-3及びHES-5の発現 は認 めなかった｡ 解析 ではMASH-1,MATH･ mycの抑制 に テ トラサイ ク リン投与後の分化過程 での経時的変化 を見 る と,神経分化抑制因子 であるHES-1mRNAはⅤ伴 い一過性 に増加 し,神経最終分化 に伴い再び減少 した｡Ⅴmycに よる転写抑制 のた めのc o ns e ns uss e que nc eがHES-1転 写開始領域 に存在す ることか ら,未分化 なHC2S2細胞 においてはHES-1mRNAの発現がⅤ一 mycによ り抑 え られてお り, その抑制解除によ り発現が誘導 された可能性 がある｡ MASH-1mRNAは分裂増殖 中のHC2S2細胞 において著明 に発現 し,免疫組織化 学 に よ り細胞核 内に蛋 白発現 を認 め たが,MASH-rmRNAは 3日後 よ り発現が減少 し,MASH-1蛋 白も 5日後 には殆 ど全細胞 で発現が減弱 していた. Ne ur o Dは神経最終分化 の開始 に,NDRFは一部成熟神経細胞 にも発現 しその形質 の維持 に関与す る と考 え られてい る｡ この系では分裂増殖 中のHC2S2細胞 にもNe ur o D,NDRF mRNAの発現 を認 め,その発現 は少 な くともテ トラサイ ク リ ン投与 5日後 まで減少せず持続 した｡ Ne ur o D, NDRFmRNAはMASH11と対照的 に最終分化 を遂 げた神経細胞 に も発現 してお り,i nv ivoにおいてMASH-1よ りさらに分化 の進 んだ段階で発現が見 られ る事実 に一致す るO これ らの結果 よ りHC2 S2 細胞 が成熟 ニ ュー ロンに神経最終分化 を遂 げるためにはHES11及 びMASH-1の発現が抑 え ら ur o D及びNDRFが最終分化 を制御す る過程 に関与 してい る可能性 が示唆 された｡ また,HC2 S2 細胞 は れ る必要があ り,Ne - 437- 既 に神経 に運命決定 されてい ると考 え られ ,Ⅴmycが これ ら神経特異的bas i c he l i xl o o phe l i x型転写因子 の機能を制御 し myc 発現が一旦抑制 され る と, これ ら神経特異的転写因子 て最終分化 のプ ログラムを抑制 してい る可能性が示唆 された｡Ⅴによる最終分化のプ ログラムが,神経栄養 因子等の細胞外因子の関与な しに速やかに進行す ると考えられ る｡ 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 中枢神経前駆細胞 由来の不死化細胞株 HC2S2細胞 はテ トラサイク リン投与によ りⅤmycの発現を抑制す ることで神経特 s i che l i x異的因子の発現 を伴 う神経最終分化 を誘導す ることが可能である｡ この分化過程 における経時的な神経特異的ba l o o phe l i x( bHLH)型転写因子の発現 を解析 した｡ No r t he r nbl o tに よ り発 現 を検討 した 9種 の神 経 特 異 的bHLH型 転 写 因子 の うち, MASH-1, Ne ur o D, Ne ur o Dr e l a t e df ac t o r( NDRF)及びHESl 1mRNAの発現がHC2S2細胞の分化過程 を通 じて認 め られた.テ トラサイ ク リン投与 mycの抑制に伴い一過性に増加 し,神経最終分化 に伴い再び減少 した｡Vmycによる転写抑制c o ns e 後,HES-1mRNAはVns us 配列がHES･1転写開始領域 に存在す ることか ら,Ⅴ一 myc の抑制解除によ り発現が誘導 された可能性がある｡ MASH-1 mRNAは分裂増殖 中のHC2 S2 細胞 において著明な発現 を認 めたが, 3日後 よ り発現が減少 した.MASH-1が 神経特異的因子に先行 して発現 し,神経特異的因子の発現 を促進す る分化因子 として働 き,神経最終分化後 に減少す ること を示唆 している｡ Ne ur o D,NDRF mRNAは分裂増殖 中のHC2S2細胞 にも発現を認 め,その発現は少 な くともテ トラサイク リン投与 5 日後まで減少せず持続 した｡ これ らの結果 よ りHC2S2細胞か成熟ニュー ロンに神経最終分化 を遂 げるためにはHES･1及びMASH-1の発現が抑 え ur o D及びNDRFが最終分化 を制御す る過程 に関与 している可能性が示唆 された｡ られ る必要があ り,Ne 以上の研究は噛乳類 中枢神経分化過程の解明に寄与す るところが. 多い｡ したがって,本論文は博士 ( 医学)の学位論文 として価値 あるもの と認 める｡ 0年 4月1 4日実施 の論文内容 とそれ に関連 した試問を受 け,合格 と認 め られたものであ なお,本学位授与 申請者 は,平成 1 る｡ - 438-
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