Application Note LCMS14005 高分解能・精密質量（HR/AM ）システムによる環境サンプル中の未知化合物のスクリーニングサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社キーワード HPLCシステム高分解能、精密質量、ノンターゲットスクリーニング、 Orbitrap質量分析計オンラインサンプル濃縮システムには、 Thermo Scientific™ EQuan™ を使用しました（図 1）。容量 1000 µL のサンプルを Thermo Scientific Hypersil GOLD™ 20 × 2.1 mm トラップカラムに注入し、Thermo Scientific Accucore™ RP-MS 分離はじめにカラムにより分析しました。図 2 に示す溶媒グラジエントを採用 LC-MSによる食品および環境サンプル中の汚染物質のターゲッしました。これにより、サンプル注入、オンライン濃縮、クロマトグト分析と定量分析は、迅速かつコスト効率に優れたルーチンアプラフィー分離の合計サイクル時間が 15 分となりました。リケーションとなりました。しかし、ターゲットしていない化合物が含まれていた場合は、この方法では対応できません。また、 MSシステム LC-MSによるノンターゲット分析は、手間と時間がかかり、ルー Thermo Scientific Exactive™ Plus 質量分析計を使用し、フルチンアプリケーションにすることは非常に困難でした。スキャン/All Ion Fragmentation（AIF ）モードで分析を行いまし当社は、ルーチンでスクリーニングと定量を一連のワークフローた。このモードでは、フルスキャンと AIF スキャンが交互に実施さに統合したソフトウェアを開発しました。このソフトウェアは、候れます。分解能は、 70,000（m/z 200 における FWHM ）に設定補化合物をスクリーニングおよび定量する機能と、未知化合物をスクリーニングする機能を連携しており、ターゲット分析に加え、しました（図 3）。質量範囲を m/z 103 ∼ 900（AIF スキャン： m/z 70 ∼ 870、分解能 35,000）に設定し、存在する可能性のあ手間のかかっていたノンターゲット分析のルーチン化も可能にしる汚染物質に対応できるようにしました。システムの質量軸の校ました。本アプリケーションノートでは、一つのデータセットを使用して、正は、校正用標準混合液を使用して、測定前に 1 回実施しました。それ以外の機器の最適化（チューニング）は不要でした。高度に自動化されたルーチンのハイスループット定量分析と汎用性の高いノンターゲット分析を行う方法を示します。 Accela 600 ポンプオートサンプラー大容量サンプルループ 6ポートバルブ 6ポートバルブ通常容量サンプルループ Accela 1250 ポンプ 6ポートバルブ 3 µm Accucore RP-MS 分離カラム図 1：EQuan オンライン固相抽出および分離システムの概略図メソッドサンプル前処理表流水サンプルを四つの異なる地点から採取し、前処理を行わず、そのまま分析しました。また、標準液（対照）1 サンプルおよび水道水（参照）1 サンプルを、同時に分析しました。 12 µm Hypersil GOLD 濃縮カラム 2 結果候補化合物スクリーニング未知化合物スクリーニングより簡単な手法として、候補化合物スクリーニングがあります。この手法では、サンプル中に存在している可能性のある化合物を多数含むリストを使用します（図 4）。このスクリーニングでは、網羅的に環境汚染の原因物質を検出することはできませんが、保持時間やマススペクトルの確認のために標準物質を使用する必要はありません。本検討では、約 1,000成分の化合物名、元素組成、フラグメント情報が登録されている内蔵データベースを使用しました。さらに、約 4,000 の HR/AM MS2スペクトル情報が含まれているスペクトルライブラリーも、ソフトウェア上で利用可能です。最終的に、同位体パターンマッチング、フラグメントイオン検索、 MS2ライブラリー検索の各機能を用いて結果を確認しました。確認に用いた 3 種類の項目がすべて一致する、多数の汚染物質が同定されました。一方、同一バッチで分析した標準液（通常は、このようなサンプルのターゲット分析で使用）の結果を見ると、図 2：LC グラジエント条件この手法では、サンプルに含まれるすべての化合物を同定できないことも明らかとなりました。さらに、フラグメントイオン情報とライブラリースペクトルが、確認のための追加情報として役立つこデータ解析とも判明しました（図 5）。データ解析には、Thermo Scientific SIEVE™ 2.1 ソフトウェア上記に加えて、2,900 成分の情報が含まれている大規模データおよび Thermo Scientific TraceFinder™ 3 .1 ソフトウェアをベースも使用しましたが、このリストに含まれていない汚染物質使用しました。TraceFinderで取得したデータは、自動的にSIEVE が存在する可能性を否定することはできませんでした。に送られ、解析後にTraceFinder上で結果を確認できます。最終処理、レポート作成、アーカイブについても、 TraceFinderで確認できます。図 3：Exactive Plus メソッド設定 3 図 4：候補化合物スクリーニングの結果画面未知化合物スクリーニング候補化合物スクリーニングで検出できない化合物があったため、未知化合物スクリーニングを実施しました。このスクリーニングでは、差異解析ソフトウェアSIEVE に測定結果を送り、試料間で差異がある成分の解析を行いました。必要な設定やパラメーターはすべて TraceFinder から SIEVE に自動的に送られます。第一段階では5,000 の成分が検出されましたが、意味のない成分も含まれるため、リストの絞り込みが必要です。そこで、参照サンプルとして水道水を使用し、結果リストからマトリックスシグナルとバックグラウンドシグナルを除去する処理を行った結果、リスト図 5：候補化合物スクリーニングにおける 3 段階の確認: 同位体パターンマッチング、フラグメントイオン検索、MS2ライブラリー検索。A: 同位体パターンの比較、B: フラグメントイオンの比較、C: MS2ライブラリーの比較に残った成分は 1,829 になりました。このリストの主成分分析を行いました。その結果、3 種類の水サンプルの類似性が非常に高いことが明らかになりました。一方、成分に差異が認められる水サンプルが 1 種類（図 6、表流水1を参照）ありました。データをフィルター処理することにより、これらのサンプル間の差を示す成分を抽出することが可能です。 4 標準表流水 2 表流水4 表流水3 水道水表流水1 図 6：主要な差異に関する主成分分析（PCA: principle component analysis ）結果次に、表流水 1 サンプルと表流水 2 サンプルの主要な差異のみこの検索により、 1,529 の成分が同定されました。この結果リスを検出するフィルターを設定しました（図 7）。その結果、リストをトは、SIEVE アプリケーションを終了した際 TraceFinderに自動 1,671 成分まで絞り込むことができ、ChemSpider データベー的に送信され、新しい化合物データベースとしてインポートされまスに送り、化合物の同定を実施しました。す。図 7：SIEVE による未知化合物スクリーニング結果の確認（プロピコナゾールの例）。所定の保持時間における抽出イオンクロマトグラムからは夾雑物質の影響のないクリアなシグナルが得られ、同位体パターンマッチングではほぼ完全に重なることを確認できます。 Application Note LCMS14005 得られた結果の確認とレポート作成のため、この化合物データ A ベースを使用して、候補化合物スクリーニングを実施しました。結果をTraceFinderに戻すと、ターゲット分析、候補化合物スクリーニング、未知化合物スクリーニングのすべてを一つのソフトウェアで取り扱うことができ、一つの解析画面上で結果のレビューとレポート作成ができるという利点があります。一部の化合物が多数のマトリックスと共溶出していることが明らかになり、また、周囲のマトリックスから重要なシグナルを抽出す B ることが可能で、シグナル強度が低くても質量精度を完全に維持することができました。図 8 に、ロキソプロフェンの例を示します。周囲のマトリックスシグナルは、化合物のモノアイソトピックおよび同位体シグナルとほぼ同じ強度で検出されていました。しかし、対象化合物のシグナルは、マトリックスシグナルやバックグラウンドシグナルから十分に分離されており、化合物を簡単に検出し確認することができます。このように対象化合物とマトリックスのシグナルを明確に分離できる理由は、この分析で採用した高い分解能、R = 70000（m/z 200）によるものです。図 8：化合物同定のために高い分解能を用いる重要性: モノアイソトピックシグナル（ A ）および同位体シグナル（B ）は、同程度の強度のマトリックスシグナルに囲まれており、本実験で使用した高い分解能でのみ分離が可能最終的な解析を一つのソフトウェアで実施するため、ターゲット分析、候補化合物スクリーニング、未知化合物スクリーニングの結結論果を簡単にまとめることができ、結果のレポート作成とアーカイ環境分析において、一つのアプリケーション内で高度に自動化さブも一つのステップで行えます。二つのソフトウェア間のデータ送れた未知化合物のスクリーニング分析が、ターゲット化合物およ受信はすべて自動的に行われます。表 1 に、最初のターゲットスび候補化合物のスクリーニングで対応できない部分をカバーできクリーニングでは検出されず、未知化合物スクリーニングでは検ることがわかりました。高分解能・精密質量分析計Orbitrap™ の出された化合物の例を示します。一つであるExactive Plus の分解能は、分析対象化合物のピークをマトリックスシグナルやバックグラウンドシグナルから分離するために役立つことから、得られた結果の選択性および信頼性を支える原動力となっています。表 1：ターゲット分析および候補化合物スクリーニングでは検出されなかった汚染物質の例化合物名ビソフロロールカンデサルタンカルボフランジベンジルアミンイルベサルタンロキソプロフェンメキサカルベートオキサゼパムプロピコナゾールトラマドール化学式） RT（測定値）同位体パターンスコア（% ） m/z（Apex ） m/z（Delta（ppm ） C18 H31 NO4 C24 H20 N6 O3 C12 H15 NO3 C14 H15 N C25 H28 N6 O C15 H18 O3 C12 H18 N2 O2 C15 H11 ClN2 O2 C15 H17 Cl2 N3 O2 C16 H25 NO2 326.2330 441.1671 222.1127 198.1277 429.2401 247.1332 223.1443 287.0584 342.0774 264.1961 0.57 -0.50 -0.19 -0.66 -0.03 0.45 -0.06 0.48 0.21 0.10 5.12 6.56 5.18 7.31 6.45 5.52 5.53 6.29 7.43 4.35 100 100 98 98 100 85 96 96 89 100 本アプリケーションノートは、ASMS2013ポスターから抜粋しました。 Ⓒ 2013 Thermo Fisher Scientifi c Inc. 無断複写・転載を禁じます。ここに掲載されている会社名、製品名は各社の商標、登録商標です。ここに掲載されている内容は、予告なく変更することがあります。ここに記載されている製品は研究用機器であり、医療機器ではありません。サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社分析機器に関するお問い合わせはこちら TEL 0120-753-670 FAX 0120-753 -671 〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町3 -9 E-mail : [email protected] www.thermoscientific.jp E1406