Application Note CI14001 細胞イメージアナライザーを使用した in vitro 小核試験の自動化法 サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 Introduction 遺伝毒性試験は、化学物質の持つ発がん性や遺伝毒性を予測す るスクリーニング試験であり、医薬品、化粧品、農薬、一般化学品 等の新規登録申請に関する法規・ガイドラインに定められた化学 品安全性試験の一つです。小核試験は、この遺伝毒性試験の代表 的な手法の一つです。しかし、既存のin vitro 小核試験では、測定 者が顕微鏡を用いて目視で細胞のカウントを行っており、時間が かかる、複数の熟練作業者を要する、主観に左右されやすいなど の理由から、多数の化合物についての試験は、コストや時間の面 細胞死 細胞傷害 から非常に難しいとされてきました。当社では、細胞イメージアナ 遺伝毒性物質 （3-20 hr） ライザー Thermo Scientific™ ArrayScan™ VTI（解析に対応 細胞質分裂ブロック （21-45 hr） した最新機種は、Thermo Scientific™ ArrayScan™ XTI およ 図2 : 細胞質分裂ブロック法を用いた小核誘発 び Thermo Scientific™ CellInsight™ NXTです）を使用して自 遺伝毒性物質で特定の時間処理された細胞は、細胞死（青色の 動化in vitro 小核試験を実施しました。この自動化in vitro 小核 多核細胞）、細胞傷害（緑色の核）または小核を形成します。さら 試験では、より客観的で均一性の高い結果を短時間で得ること にアクチン重合阻害剤（細胞質分裂阻害剤）のサイトカラシンB が可能となります。 を添加し、特定の時間処理すると、細胞質分裂がブロックされ る、または小核形成が誘発されます。 方法 CHO-K1細胞をコラーゲンコートした96ウェルプレートに播種 Thermo Scientific ArrayScan XTI し （1ウェル当たり3 ,000 細胞 /100 µ L、F-12 K 培地）、一晩培養 （37℃、5 % CO2、18 時間∼ 24時間） し、これに Micronucleus Kit （製品コード K11-0001-1）のCellular Dye Solution（細胞 染 色色素）を添加し、37℃で1時間培養しました。洗浄後、マイトマイ シンCまたはブレオマイシンを添加し、20 時間培養 （37 ℃、5 % CO2）しました。その後、サイトカラシンBで28 時間処理し、細胞 分裂をブロックし、二核細胞の状態に維持します。サンプル調製 Thermo Scientific CellInsight NXT 図1 : 細胞イメージアナライザー 最新機種 後、 Thermo Scientific™ Micronucleus HCS Reagent Assay KitのPermeability Dyeで細胞を染色し、固定、Hoechst Dyeで染色しました。続いてArrayScan VIT（20×対物レンズ）に 搭載したBioApplication解析プロトコルからMicronucleusを用 いて、イメージ撮影・解析を実施しました。 各蛍光色素の検出条件 Micronucleus Cellular Dye = Excitation 540 nm / Emission 566 nm A B Permeability Dye = Excitation 491 nm / Emission 509 nm Hoechst Dye = Excitation 350 nm / Emission 461 nm ▼ Step 1：サンプル調製 コラーゲンコートされた 96 ウェルプレートに、 CHO-K1細胞を 3,000 細胞 / ウェルで 播種し、一晩培養 細胞イメージの 自動取得・解析 ▼ サイトカラシン B で 28 時間処理し、 細胞分裂をブロック Selected Nuclei 二核細胞 （緑・紫色 点線枠） の小核 （水色枠） 存在率を自動算出 図4 : Micronucleus BioApplicationでの検出例 A Hoechst Dyeで染色した核（青色）、 Cellular Dyeで染色した細胞質（緑色） ▼ 各濃度の化合物を添加し、 37℃、5% CO2 下、 20 時間培養 Targeted Cell Step 2：イメージ取得・解析 Micronucleus Assay ▼ Step 3：遺伝毒性予測 解析後のデータから 毒性の閾値を決定し、 化合物の毒性を 判定・予測 ▼ Micronucleus Kit を 使用して固定した細胞を、 染色・洗浄 図3 : 小核試験 ワークフロー B 二核細胞（緑・紫色 点線枠）の小核（水色枠） MicronucleusのBioApplicationを使用することで、二核の細胞 （OECDガイドライン推奨）だけをターゲットとして（多核や単 核は除外可能）小核存在細胞の比率や死細胞の存在率を自動計 算することが可能です。 25 20 %MicroNucFrequency 2 Bleomycin Mitomycin C 15 10 5 0 結果・考察 CHO-K1細胞を、12ポイントの用量逓減でマイトマイシンCまた 100 101 102 103 104 Dose（ng/mL） はブレオマイシン （ともに遺伝毒性が確認されている化合物）で 図5 A：マイトマイシン Cおよびブレオマイシン処理後の小核 出現率の用量 -反応曲線 処理しました。用量-反応曲線の試験結果から、マイトマイシンC 表 1：マイトマイシン Cおよびブレオマイシン処理の結果 のEC50 値は150 ng/mL、最 高 用 量は800 ng/mLと示されま ネガティブ マイトマイシンC ブレオマイシン コントロール （800 ng/mL） （20 µg/mL） した。また、ブレオマイシンのEC50 値は2 µg/mL、最高用量は 20 µg/mLと示されました（図 5 A ）。図 5 Bには最高用量で細胞 を処理した代表的画像を示しました。 小核の出現率 （% Micronucleus Frequency） 多核/単核 比率 細胞傷害性細胞率 （% Cytotoxic Cells） 1.30% 18.40% 14.70% 11.3 1.7 2.8 0.30% 3.40% 2.30% 図5 B：マイトマイシン Cおよびブレオマイシン処理の評価 ネガティブコントロール： 通常細胞の小核出現率、多核細胞/単核細胞の割合および細胞傷 害を受けた細胞の割合を示しています。 マイトマイシン C（800 ng/mL、最高用量） ： 小核出現率が18 .4 %に増加しましたが、多核細胞/単核細胞比 は1 .7倍に減少、細胞傷害性細胞の割合は若干増加しました。 ブレオマイシン（20 µg/mL、最高用量） ： マイトマイシンC同様、小核出現率の増加がみられましたが、多 核細胞/単核細胞比は2 .8倍になりました。 盲検顧客サンプルを用いた相互検証 要約 当社では、 製薬会社5社から提供された25の化合物の盲検試験を 自動化in vitro 小核試験により、従来の目視による試験法の問題 実施しました。それぞれの未知の化合物について、 3種類のプレー を軽減することができます。 3 トで、50 µMからの8ポイントの用量-反応曲線を求める試験を行 いました （必要性が認められたサンプルについては、 500 µMの高 - 顕微鏡スライドの代わりに96ウェルプレートフォーマットを用 用量で再試験実施）。従来の目視によるマニュアル解析 （従来法） いることで1度に複数の化合物について試験することができま による小核試験の結果、および染色体構造異常試験の結果を比 す。これにより、化合物の遺伝毒性を定量的に評価する時間を 較した結果、自動化in vitro 小核試験 （自動化法）のデータは、 23 数日から数週間短縮することができます。 サンプルについて各社の社内の従来法による試験結果と一致し ました （Cuda, 2004）。 ・ 従来法と自動化法のデータの全一致率は92 % ・ 偽陽性は0件 ・ サンプル必要量は、ほとんどの化合物で0.1 mg以下 また、従来法では同様の解析に1年以上要していましたが、自動化 法では完了までに要した時間は2週間でした。 自動化法 vs 従来法 医薬品候補化合物の安全性を早期にスクリーニングすることが、 創薬後期ステージでの失敗を防ぎ、費用を削減することにつなが ります。自動化in vitro 小核試験は、遺伝毒性および細胞傷害性 - 遺伝毒性と同時に、細胞傷害性の初期および後期の兆候につ いても評価することができます。 - 薬剤探索プロセスにおいて、初期段階での遺伝毒性化合物の 同定を可能にします。これにより時間と費用を節約することが できます。 - プレートの各ウェルから撮影された画像から細胞単位および ウェル単位で解析を実行し、 小核形成のより客観的な解析をす ることができます。 - 自動化解析により、研究者の時間や労力を削減できます。 当社の自動化小核試験では、正確でコスト効率の高い、バイアス のない遺伝毒性試験法で、生産効率を改善することが可能となり ます。 について化合物をスクリーニングするための客観的で、コスト効 率の高い方法といえます。 自動化法のプラットフォームにはArrayScanやCellInsightなど の細胞イメージアナライザー、Micronucleus BioApplicationの 解析プロトコル、 およびMicronucleus HCS Reagent Kitが含ま れ、スループットの向上および化合物についてのより良い判断が 可能です。 表 2：自動化法 vs 従来法 自動化in vitro 小核試験 従来の マニュアル解析 0.1 – 5 mg 10 – 50 mg > 40 ∼1 1 – 2時間 (10ポイント用量-反応) 2日間 4条件 40化合物でのコスト 4,000ドル 540,000ドル 結果までの所要時間 1週間 3∼12週間 ・ 化合物および労働力の使用を低減することでコスト効率が向 上 ・ 迅速な結果 ： わずか1週間で多数の化合物の結果を提供 ・ 客観的で一貫したスコアリング ： バイアスおよび研究者ごと のバラツキを低減 ・ OECDガイドラインに則って動 物実 験の前の 化合 物のスク リーニングを実現 ・ 培養細胞における遺伝毒性および細胞傷害性の検出用として バリデート済みのアッセイキットの使用 サンプルの必要量 スループット （化合物/週） 1化合物当たりに 必要な時間 References Maier, P., and W. Schmid.（1976）Ten model mutagens evaluated by micronucleus test. Mutation Research 40, 233-246. Hayashi, M., Sofune, T., and M. Ishidate.（ 1984）Apilot experiment for the micronucleus test. The multi-sampling at multi-dose levels methods. Mutation Research 141, 165-169. Fenech M and A Morley.（1985）Solutions to the kinetic problems in the micronucleus assay. Cytobios 43, 233-246. Fenech M and A Morley.（1985）Measurement if micronucleui in lymphocytes. Mutation Research 147, 29-36 Fenech M（1997）the advantages and disadvantages of cytokinesis-block micronucleus methods. Mutation Research 392, 11-18 Application Note CI14001 Ⓒ 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. 無断複写・転載を禁じます。 ここに掲載されている会社名、製品名は各社の商標、登録商標です。 ここに掲載されている内容は、改善のために予告なく変更することがあります。 サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 バイオサイエンス事業本部 TEL 0120 -753 -670 FAX 0120 -753 -671 学術お問い合わせ info.bid.jp@thermofisher.com www.thermoscientific.jp/cellomics J0386_E14F_010
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