補足：分子量の求め方 SDS－PAGEの泳動像から分子量を推定するには？タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質のものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる同じゲルの中で既知のタンパク質（分子量マーカー）を泳動する分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する移動距離を片対グラフにプロットするこれを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める SDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質タンパク質ミオシン βガラクトシダーゼフォスフォリラーゼb フルクトース-6-リン酸キナーゼウシ血清アルブミングルタミン酸デヒドロゲナーゼ卵白アルブミン乳酸ジヒドロゲナーゼカーボニックアンヒドラーゼトリオースリン酸イソメラーゼトリプシンインヒビターリゾチーム αラクトアルブミンアプロチニン由来ウサギ骨格筋 E .coli ウサギ骨格筋ウサギ骨格筋ウシ血清ウシ肝臓ニワトリ卵白豚骨格筋ウシ赤血球ウサギ骨格筋大豆卵白ウシ赤血球ウシ肺分子量（Da） 205,000 116,000 97,000 84,000 66,000 55,000 45,000 36,500 29,000 26,600 20,100 14,400 14,200 6,500 分子量算出の手順～バンドが綺麗に揃ったゲルの場合～１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの移動距離を正確にはかる分子量マーカーサンプル 3.6 6.7 12 .7 23.6 33.5 44.6mm ２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする Protein Phosphorylase b Albumin Ovalbumin Carbonic anhydrase Trypsin anhydrase α-Lactalbumin 分子量(M.W.) 移動距離（㎜） 97000 3.6 66000 6.7 45000 12.7 30000 23.6 20100 33.5 14400 44.6 ３）移動度－分子量標準曲線を求める 100000 -0.7341 分子量（M.W.） y = 267249x 2 R = 0.9816 10000 0 10 20 30 移動距離（mm） 40 50 ４）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる５）その数値を３）で求めた標準曲線の式（y＝267249ｘ－0.7341）に代入し分子量を算出する分子量マーカーサンプル 28.5mm 267249×28.5 －0.7341＝22851.49 求めるタンパクの分子量分子量算出の手順～スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合～１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの移動距離を正確にはかる２）レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる分子量マーカー BPB サンプル３）フロントラインの移動距離を１として、それぞれの分子量マーカーのバンドの移動距離の相対値（＝相対移動度：Rf値）を計算する分子量マーカーサンプル 0.25 0.67 1.0 ４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする５）Rf値－分子量標準曲線を求める Protein Phosphorylase b Albumin Ovalbumin Carbonic anhydrase Trypsin anhydrase α-Lactalbumin 分子量(M.W.) 97000 66000 45000 30000 20100 14400 Rf値 0.07 0.13 0.25 0.47 0.67 0.89 100000 -0.7245 分子量（M.W.） y = 15154x R2 = 0.9813 10000 0 0.2 0.4 0.6 Rf値 0.8 1 ７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる８）そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントラインの移動距離をはかる９）フロントラインの移動距離を１として、目的のタンパク質のＲｆ値を計算し５）で求めた標準曲線の式（y=15154x－0. 7425）に代入すると、分子量が算出できる分子量マーカーサンプル 0.57 1.0 15154×0.57 －0.7425＝22771.73 求めるタンパクの分子量二次元電気泳動での分子量マーカーの使い方分子量マーカーのバンド SDS-PAGEで分子量を測定する上での注意点・塩基性に富んだタンパク質はSDSの結合量が少なくなるため、移動度が小さくなる＝見かけの分子量が大きくなる・タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、SDSの結合量も多くなり、移動度が大きくなる＝見かけの分子量が小さくなる・糖タンパク質や酸性タンパク質はSDSの結合量が少なく、移動度も小さい＝見かけの分子量が大きくなる・多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、SDS-PAGEでわかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で機能している状態の分子量はわからない例）免疫グロブリン＝重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をもつ S-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れる免疫グロブリンの構造 2本のL鎖と2本のH鎖で構成されている黄色い部分＝Light chain （L鎖）緑色の部分＝Heavy chain （H鎖） L鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれている