2B19 極低温時間分解蛍光測定による好熱性シアノバクテリア T. vulcanus 光化学系 II の二量体と単量体のエネルギー移動の比較 ○西俊輔＊, 小村理行＊, 野地智康＊, 川上恵典＊＊, 沈建仁＊＊, 柴田穣＊, 伊藤繁＊（名古屋大学理学研究科＊岡山大学大学院自然科学研究科＊＊） [序] 光合成は光エネルギーで電荷分離反応を起こし、多段階の電子移動を経て有機化合物を合成する。光反応は、2 種の色素-膜タンパク質複合体(光化学系 I と光化学系 II) で進む。多数のアンテナクロロフィル(Chl)が光エネルギーを捕集し、励起エネルギーは効率よく高速で反応中心に運ばれ、化学エネルギーに変換される。光化学系 II は、外部アンテナタンパク質と、コアアンテナ CP43、CP47、そして電子移動を行う反応中心（RC）からなるコア複合体からなり、これが二量体を形成し、チラコイド膜上に存在している。CP43, CP47 上の 40 分子程度の Chl 間で高速のエネルギー移動が起こるが、エネルギー捕集経路の詳細は解明されていない。我々の研究室では、エネルギー移動の速度が遅くなる極低温 4 K でのピコ秒蛍光寿命測定を行ない、エネルギー移動過程を解析してきた。得られた Decay Associated Spectra （図１）は、CP43 上の F685 と CP47 上の F695 と F689 の 3 つの蛍光帯間でのエネルギー移動を示唆し、これを説明するために図２のように光化学系 II コア複合体単量体 2 つの間でのエネルギー移動があるというモデルが考えられた（１）。本研究では、このモデルの妥当性を検討するために、単量体と二量体の測定をおこない、図２のモデルから予想されるような蛍光減衰の差が出るかを検討した。本研究では、好熱性シアバクテリア Thermosynechococcus(T.) vulcanus から精製した光化学系 II コア複合体の単量体と二量体を試料として、極低温でのピコ秒時間分解蛍光寿命測定行い、このモデルの妥当性について議論する。 [実験] シアノバクテリア T. vulcanus の膜系をとり、界面活性剤処理のあとクロマトグラフィーで光化学系Ⅱ単量体、二量体を各々精製した。試料を緩衝液で希釈し、低温での透明度を保つためにグリセロールを体積比 60％に混合した。温度を下げることでエネルギー移動の速度を遅くして、より詳細なエネルギー移動を調べるため、4 K、40 K 、 77 K でストリークカメラを用い、時間分解蛍光を得た。励起波長は 430 nm、レーザーパルス 150 fs、繰り返しは 80MHz で測定した。 Annual Meeting of Japan Society for Molecular Science (2009) 図１図２ [結果と考察] 図３と４は、単量体と二量体の 4 K でのクロロフィル蛍光寿命測定から得られた、ピーク波長付近の蛍光減衰曲線と時間分解スペクトルである。単量体の減衰が二量体の減衰よりも僅かに遅くなっていたが、あまり大きな差はない。図４の時間分解蛍光スペクトルもほぼ同じであった。これらの結果が単量体間での何らかのエネルギー移動を示している可能性があるが、図２のモデルから予想されるような大きな変化ではなかった。発表では図２のモデルを含め、より実験結果を再現できるようなエネルギー経路のモデルを考慮し、議論する。二量体単量体 12 1 10 0.1 8 二量体単量体 0.01 6 4 0.001 0 1 2 3 time (ns) 4 5 2 図３ 675 680 685 690 695 700 wavelength (nm) 705 710 図４参考文献 (1) M. Komura, Y.Shibata, S.Itoh Biochimica et Biophysica Acta 1757 (2006) 1657–1668 Annual Meeting of Japan Society for Molecular Science (2009) 2B20 光化学系 I 反応中心における極低温での超高速光捕集機構の解析（名大院・理） ○柴田穣、山岸篤史、伊藤繁 [序] 光化学系 I (PS I)反応中心は、植物やシアノバクテリアなどの酸素発生型光合成における二つある光化学系のうちの一つで、700 nm 付近に吸収ピークを持つ P700 と呼ばれるクロロフィル (Chl)-a 二量体で起こる光誘起電子移動により高い還元力を作り出し、NADPH を生成する。PS I には、一つの P700 あたり約 100 個の Chl-a 分子がアンテナ色素として結合している。そのうちの 10 個弱の Chl 分子は red Chl と呼ばれ、 P700 よりも低い励起エネルギーを持っており極低温で 730 nm 付近に特有の蛍光を示す。効率的なエネルギー捕集には不利と思われる red Chl の機能は分かっていない。どの Chl 分子が red Chl を構成しているのか、いくつかの候補は挙げられているが、最終的な決着には至っていない。我々は、 PS I において red Chl を含む多数のアンテナ Chl から P700 へのエネルギー捕集経路およびその kinetics を明らかにすることを最終的な目的として、極低温での超高速蛍光測定を行ってきた。極低温にすることでエネルギーの低い準位から高い準位への遷移が抑制され、エネルギー捕集過程は一方通行となる。このことにより単純化されたエネルギー捕集過程を解析することで、上記の目標を達成することを目指している。昨年の討論会では植物の PS I についての結果を報告したが、今回は周辺アンテナのないシアノバクテリアの PS I についての結果を基に PS I 内でのエネルギー伝達経路について考察する。図 1 は、シアノバクテリア、 Thermosynechococcus (T.) elongatus 由来の PS I で得られた 15 K での Decay 1.0 Associated Spectra (DAS)である。この DAS からは、以下のことが読み取れる。1) ～6 ～730 nm にピークを持つことから、励起エネルギーは数 ps 以内に red Chl へと流れ込んでいる。2) 6 ps、140 ps、 360 ps の減衰成分を示す３種 Amplitude [A.U.] ps の高速の DAS 成分が 720 0.5 0.0 100 fs 1.32 ps 6.11 ps 34.5 ps 139 ps 357 ps -0.5 類の red Chl の存在が示唆される。今回は、X 線結晶構造 -1.0x10 4 解析から得られている PS I の構造に立脚してこの結果を解釈し、エネルギー伝達経路、red Chl の位置、などについて考察する。 660 680 700 720 Wavelength [nm] 図 1 Annual Meeting of Japan Society for Molecular Science (2009) 740 760 [方法] 最近 T. Renger らのグループは、植物のもう 1 つの反応中心、光化学系 II（PS II）のエネルギー捕集過程について、その構造に立脚した解析を行った[1]。彼らはまず、ある Chl ペア間での励起子相互作用がある閾値よりも強い場合にその二つは同じグループに属するとのルールにより、多数のアンテナ Chl をいくつかのグループに分割した。閾値として、典型的なタンパク質中 Chl の再配置エネルギー、36 cm-1 という値を採用している。分割された各グループ内の Chl 励起状態は、非局在化して励起子を形成すると考え、グループ内のエネルギー捕集過程は励起子間緩和という形で進行すると解釈する。グループ間のエネルギー移動は、住らなどにより提唱されている一般化 Förster 機構[2]により平衡化した励起子間で進行する、としている。このようなモデルにより彼らは、PS II における過渡吸収などの実験結果をシミュレーションにより再現することに成功している。励起子相互作用の強さは、構造データを基に計算可能であるので、結晶構造の得られている PS I にもこの手法を適用することができる。我々は、彼らの手法に倣い PS I の約 100 個の Chl 分子をグループ化し、極低温での蛍光ダイナミクスが再現できるかを検証した。 [結果と考察] 図 2 には、ほぼ膜面垂直方向、スペシャルペアの側から見た T. elongatus の PS I の結晶構造に含まれる全ての Chl 分子の配置を示した。構造に基づいて Chl ペア間の励起子相互作用を計算し、同じグループに属すると判定された Chl を同色で示している。今回の計算では、 Chl 分子の Qy 遷移双極子の強度は 4.5 D とし、同グループへ属するかの判定に用いる閾値は、 Renger らの報告に倣い 40 cm-1 とした。図 2 の中央付近に位置する赤で示した Chl のグループは、 P700 スペシャルペアを含む 7 つの分子が属しており主に電子伝達鎖を構成している。赤で示したグループから一定距離離れて、環状にアンテナ Chl が配置されている様子が分かる。どのグループにも属さない Chl は、薄い灰色で示した。PS I では、一つのグループに属する Chl 分子の数が PS II の場合より多くなる傾向が見られた。特に青および緑で示したグループは、ともに 30 個近い Chl 分子を含む大きな領域を形成している。我々の実験結果は、red Chl へのエネルギーの流入が数 ps 以内という非常に高速に完了することを示しているが、これは多くの Chl を含むグループ内での高速の励起子緩和により起こっているということで説明できる。今後、グループ内での励起子固有状態、それらの間のエネルギー移動速度を計算し、実際に得られた実験結果を再現可能か検証する。講演では、理論モデルによるシミュレーション結果を報告し、モデルの妥当性および予想されるエネルギー捕集経路について議論する。 [参考文献] [1] G. Raszewski, and T. Renger, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008), 4431. [2] H. Sumi, J. Phys. Chem. B 103 (1999), 252. Annual Meeting of Japan Society for Molecular Science (2009) 図 2 2B21 光センサータンパク質フォトトロピンの光反応と隠された機能（京大院理 1・府立大理 2）中曽根祐介 1)、直原一徳 2)、松岡大介 2)、徳富哲 2)、鈴木友美 1)、長谷あきら 1)、○寺嶋正秀 1) 【序】多くの生命は外界を認識し応答するため、多くのセンサーを持っている。通常は、すでに機能の知られた生体タンパク質の物理化学的測定を行い、反応機構を明らかにする分子科学的研究がおこなわれる。例えば、我々はフォトトロピンと呼ばれる植物の持つ青色光センサータンパク質の反応機構に興味をもち、研究を進めてきた。このタンパク質は、光屈性・葉緑体の光低位運動・気孔の開閉運動を制御するタンパク質であり、光検出を担うドメインとして Light-Oxygen-Voltage-sensing (LOV)ドメインを有している。光反応に伴う体積変化や拡散係数変化を高い時間分解能で測定可能な過渡回折格子（TG）法を適用することで、従来の測定手法では検出が困難な LOV ドメイン間の会合・解離反応や LOV ドメインの C 末端に隣接するヘリックスの崩壊過程を時間分解で検出してきた 1,2。ところが、我々はその研究過程で、非常に大きな反応の温度依存性を見出した。この反応の温度依存性の意味を考えてみると、生体内でも、こうした温度依存的な機能を持っているのではないかと推察され、このことはフォトトロピンが温度センサーとしても働いているのではないかという推測を導く。もしこれが実証されれば、分子科学的研究から逆にこれまで知られていなかった機能を明らかにできることになり、非常に興味深い。これまで調べてきた反応機能の温度依存性と対応させて、実際に植物でそうした温度センサーとしての機能をはたしているのかどうかについて調べた。【実験】フォトトロピンは光受容を担う二つの LOV ドメイン（LOV1、LOV2）と、活性化反応を示す Ser/Thr キナーゼドメイン、さらに LOV2 とキナーゼを結ぶ linker から構成されている。LOV2 ドメインがキナーゼドメインの活性制御に特に重要であると考えられており、また linker 部分に存在するへリックスが構造変化を起こすことから、この部位もシグナル伝達に重要であるという見解が広く持たれている。これら重要部位の初期状態や光誘起反応に対する温度効果を調べるために、フォトトロピン（シロイヌナズナ由来）の LOV2 ドメインに linker を付随させたもの (LOV2-linker 試料)を試料として用い、TG 法による温度変化測定を行った。また、生理機能の研究においては、シロイヌナズナの野生株(WT)とフォトトロピンを欠損させた変異株（MT）を用意し、寒天培地で 2 週間育てたあと、土に植えついでさらに 2 週間育てたものを測定に用いた。特に、フォトトロピンが制御していることが確立している、気孔の開閉運動、葉緑体の光定位運動への温度効果を調べた。【結果と考察】LOV2-linker 試料では 300 s で linker が LOV2 ドメインから解離する光反応が起こり、さらに linker 部分の図1 TG 信号の温度依存性から決められたへリックス崩壊という劇的な反応が 1ms 初期状態の平衡。低温構造のみが機能に結で誘起されることを、主に過渡回折格子び付く光反応を起こす。 (TG)法を用いて明らかにした。この光反 Annual Meeting of Japan Society for Molecular Science (2009) 応に対する温度効果を調べるために、TG 信号の温度依存性を測定したところ、温度上昇に伴い、分子拡散を示す信号強度が減少する様子が観測された。これは光励起によって構造変化を示す分子数が減少していると解釈され、初期状態に温度依存性があることが示唆される。我々はこの結果を、初期状態で既に linker ドメインが解離している分子種が温度上昇に伴い増加しており、この分子を光励起しても拡散係数変化を示さないと結論した。すなわち、初期状態が温度に依存し、さらにその光反応が初期状態に依存することが明らかになったといえる（図１）。これらの結果を基に、フォトトロピンが温度センサーとしての機能を有する可能性について調べるため、制御している機能の図２ WT とMT シロイヌナズナの低温と高温での気孔一つである、気孔の開閉運動への顕微鏡像の温度効果を検討した。図２に透過型顕微鏡で捉えた気孔の写真を示す。WT、MT とも気孔の大きさ自体には差がなかった。開口度を種々の温度に対して測定したところ、MT では開口度に目立った温度効果が見られなかった。ところが WT では温度上昇に伴い気孔の開口度が上昇する様子が観測された（図 3）。以上の結果は、植物が温度を感知して気孔の開閉を行い、そのためにフォトトロピンが重要であることを意味している。分子レベルでの反応機構から考えると、温度上昇により linker 部分が解離した分子種が増加し kinase の活性化が促進され、気孔の開口という形で現れたと解釈できる。同様に、葉緑体の定位運動への温度依存性も調べた。MT については温度を変えても光を照射しても葉緑体の定位運動が誘起されないが、WT では、光に対するレスポンスが、温度依存的であることが見出された。この結果からフォトトロピンが制御す図３ WT とMT シロイヌナズナの気孔の開口度の温度る現象の一つである葉緑体運動依存性に対しても温度効果があることがわかった。参考文献 1. Y. Nakasone, T. Eitoku, D. Matsuoka, S. Tokutomi, M. Terazima., Biophysical Journal, 91 (2): 645-653, 2006.: 2. Y. Nakasone, T. Eitoku, D. Matsuoka, S. Tokutomi, M. Terazima., J. Mol. Biol, 367 (2): 432-442, 2007. Annual Meeting of Japan Society for Molecular Science (2009)