イネ種子を基盤とする経口ワクチンMucoRiceの開発誌名農業および園芸 = Agriculture and horticulture ISSN 03695247 幸, 義和著者高岩, 文雄清野, 宏巻/号 84巻1号掲載ページ p. 46-49 発行年月 2009年1月農林水産省農林水産技術会議事務局筑波事務所 Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat 4 6 イネ種子を基盤とする経口ワクチン MucoRice の開発幸義和*・高岩文雄ね・清野宏* 〔キーワード)経口ワクチン，イネ種子，閉鎖系工場， MucoRice (ムコライス) ，感染症はじめに多くの感染症からわれわれの体を守るため，私たそれを加工して製剤化し，経口ワクチンとして用いる試み，経口ワクチン発現米 ( M u c o R i c e ) プロジェクトの概婆について述べる. 1 粘膜免疫と経口ワクチンち人類は抗生物賞とワクチンを発明した. しかし，現在問題になっている悶V，インフルエンザウイ抗生物質の乱用は多剤薬剤耐性菌を生み出し，もはルス，結核などの新興再興感染症の大半はそれらのやし、かなる抗生物質が効かない黄 oブドウ球萄な最初の侵入部位が，上気道，腸管，泌尿生殖器などど、のパンコマイシン耐性萄が出現し，さらに最近はの粘膜面であることから，粘膜での坊御が必須であ SARS (重症急性呼吸器感染症) ，新型インフルエることは自明である.しかし，現行の大半のワクチンザウイルス，エイズ，結核などの新興再現i 感染症ンは注射型ワクチンであり，血清中の中和抗体を誘の脅威が世界的に顕在化するに至って，ワクチン開導して体内防御を主体とするため，感染粘膜での免 Y u k i 発の重要性はますます大きくなってきている ( 疫を誘導できないため，多くの感染症をその入口でら 2 0 0 7 ) ある粘膜で防御できない.この粘膜函での防御機構さて，近年のバイオテクノロジーの進歩とともに，を形成しているのが，分泌型免疫グロプリン A トランスジェニック植物に代表される組換え植物 ( S I g A ) を中心とする粘膜免疫である.経口・経などの遺伝子操作技術を利用したワクチン抗原の鼻投与の粘膜ワクチンは，粘膜系ならびに全身系の横物発現系の開発，つまり今まで主として大腸菌を両方の免疫機構に抗原特異的免疫を成立させる点用いて作られていた組換えワクチンを植物に組み Y u k ia n dKiyono2 0 0 3 ). で理想的なワクチンである ( 込み，ワクチン開発を行う試みが注目されている. ワクチン抗原の植物内での生産は現行の方法に比さて，腸管には粘膜免疫システムの中核である IgAの誘導を扱う粘膜関連リンパ組織が存在し，そべて多くの利点がある.植物生産系は発酵タンク培の組織のリンパ憾胞を覆う特殊上皮細胞層には抗養系に比較して経済的であるため既存の方法に比原の取り込み口となる細胞が存在し，この細胞の直して低コストである.さらにワクチンは植物細胞内下には抗原提示細胞，リンパ球が豊富にあり，取り S t r e a t f i e l d で生合成されるためきわめて安定である ( 込まれたワクチン抗原が直に下部に存在する抗原ら 2 0 0 1 ) .植物生産型ワクチンは，初め，形質転提示締胞により捕捉され，引き続き各種免疫担当細換が容易なタバコやジャガイモなどを用いて行わ胞が感作・活性化され，最終的に抗原特異的 IgAがれてきたが，最近はトウモロコシやコメなどの穀物産生される.この粘膜ワクチンは粘膜面に感染侵入種子にワクチンを発現させる方法が注目を浴びて阻止と同時に体内での紡御の中心となる血清中和いる.穀物種子は大量に生産でき，かっ長期間室温抗体(IgG) も誘導でき，いわば粘膜と体内とのこで保存可能であり，開発途上国を含めた遠隔地へ輸段構えの訪御免疫を誘導できるため，新興再興感染送を冷蔵下で行う必要がないため ( c o l d c h a i nf r e e )，症対策確立の切り札となる世界規模で使用される G l o b a lV a c c i n a t i o n ) 世界的規模でのワクチン投与 ( Y u k ia n dKiyono ワクチンとして注目されている ( を可能にするからである (Vannusら 2 0 0 3 ) .本稿 2 0 0 3 ) (国1) では，とくに，イネ種子にワクチン抗原を組み込み，ま東京大学 i 亙科学研究所炎症免疫学分野 ( Y o s h i k a z uY u k i .H i r o s h iK i y o n o ) 帥授業生物資源研究所遺伝子組換え開発センター ( F u m i oT a k a i w a ) この粘摸ワクチンの代表的なものは経口ポリオワクチンで 9 6 0年代から使用されてい 1 3本では 1 るが，その後粘膜ワクチンの開発は進まず，最近に 0 3 6 9 5 2 4 7 / 0 9 / ￥5 0 0 / 1論文/JCLS 幸他:イネ稜子を基盤とする経口ワクチン M u c o R i c eの際発 4 7 ウムを用いる形質転換が一般的である.アグロパクテリウ経口ワクチンムは植物病原菌で、あり，植物は感染すると麗療を形成する. この腫疹形成過程で、 T-DNA と呼ばれる巨大 DNA断片が防御免疫の誘導宿主植物のゲノムに組み込ま感染部位(粘膜SーIgA) れることで形成する.このゲ { 本内 ( l I I li 青IgG ノム組込み過程で必須な領域は短く T-DNAの両末端 2 5塩基のみである.このプロセスを利用して，腫場形成関連遺図 1 経口ワクチンの概念信子を外来ワクチン抗原遺伝子に入れ替えた T iプラスミド表 1 紐換え植物に発現されたワクチン抗原といわれる T-DNAで形質転病原菌病原性大腸菌コレラ菌 B型肝炎ウイルスノーウホークウイルス狂犬病ウイルス R Sウイノレスサイトメガロウイノレス口蹄疫ウイルス伝染性胃腸炎ウイルスワクチン抗原大腸菌易熱性毒素B鎖コレラ毒素8鎖表面蛋白カプシド蛋白糖蛋白 F蛋白破傷風磁 Cフラグメント PA 抗原炭症菌糖~Ëヨ VPl蛋白 i 陪蛋白組換え植物タバコ，ジャガイモ，トウモロコシジャガイモ，コメレタス，ジャガイモタバコ，ジャガイモトマトトマトタバコアノレブアノレファシロイヌナズナ，トウモロコシタバコタバコなって欧米を中心に経口コレラワクチン，経口腸チ t 奥したアグロパクテリウムを，植物に感染させることでワクチン抗原遺伝子を様物ゲノムに組み込む.植物の種子または未熟月五組織は適当な養分を含む培地で培養するとカルスと呼ばれる脱分化した細胞塊になるが，培地のホルモンの成分を変えるとカノレスから芽が出て分化再生できる.カルスとワクチン遺伝子を含む組換えアグロパクテリフスワクチン，経鼻インフルこにンザウイルスワクチウムの共培養を通じて，この締爾から植物へワクチン，経口ロタウイルスワクチンと立て続けに上市さ音養のン抗原遺信子の導入が行われる.植物カルス i れた.しかし，これらの多くは弱毒化ワクチンとい過程で，形質転換されたカルスは選択マーカーによわれる毒性を低下させた締葱またはウイノレス自身り選択され，組換え植物として再生させ，ワクチンを使っており，ワクチンのように数十万数百万単位を発現する組換え植物を作出する ( N o c h iら 2 0 0 7 ) . の健康人(大半は幼児，子供)に接種するため，低この方法で，現在多くのワクチン抗原が植物を用頻度だが安全性の点で問題が出る場合がある.このいて発現され，また動物実験によってそれらのワクような観点から，誘導ぎれる中和抗体に対応する菌チンとしての抗原性も証明され，同時に発現された体成分の一部の抗原を遺伝子組換え技術で作製し抗原の植物内での安定性も証明された(表1).そたサブユニットワクチンの開発が進められている. の中には大腸菌易熱性毒素 8 鎖を発現させたジャ u c o R i c eプロジェクトは，われわれが進めている M ガイモやノーウオークワイルス(ノロウイルス)のこのサブユニットワクチンをイネ種子(コメ)に発カプシドタンパクを発現させたジャガイモのよう現させた経口コメ型ワクチンに他ならない. にヒトでの臨床研究を行い，ヒトでの有効であるこ 2 . 植物を用いたワクチン開発植物の形質駈換には多くの方法が報告されているが，植物発現型ワクチンの作出はアグロパクテリ t r 回 t f i e l dらとが示されつつあるものもある (S 2 0 01 )• 4 8 農業および閤芸第 84巻第 1号 3 . コメ型コレラワクチンの開発 (2009年) に存在する CTBと考えられた ( N o c h iら 2007) . このように，イネ経乳紐組の蛋白貯蔵体の中でもわれわれは今剖，コメの蛋自発現貯蔵システムに l型の大半は腎での消化分解を免れて腸管 l こ到達す注目し，コレラ毒素 B鎖 (CTB) をコレラのワクチると考えられる.経口投与された MucoRiceが，粘ン抗原としてイネの経乳組組特異的発現プロモー額免疫を介して効率よく抗原特奥的免疫J;t答を誘ターの制御下で発現させた，コメ型経口ワクチン導するためには，上記のように腸管の粘膜免疫誘導 MucoRiceCTBを調発した ( N o c h iら 2007) .この組織の特殊上皮麗に存在する抗原取り込み細胞か発現プロモーターを持つ T-DNAをイネゲノムに導ら取り込まれることが必要である.そこで，入することで，ワクチン抗原である CTB分子をイ MucoRice を微粉末化して懸濁した後に，マウス腸ネ種子であるコメの粧乳組組内の蛋白貯蔵体に特管に直接投与後，組織を取り出して，洗浄・翻定し ) .イネの経異的に発現させることができる(図 2 て CTB 特異的抗体で組織染色を行ったところ，乳細胞には通常見られる酸・アルカリに溶ける蛋白 MucoRiceCTBがこの特殊上皮膚から取り込まれるであるグ、ルテリンやグロプリンが蓄積している 2型 N o c h iら 2007) .実際，マウスことを確認できた ( 蛋白貯蔵体 ( P B I I ) のほかに，イネ特異的な有機に MucoRiceCTB懸濁液および比較対照として組換溶媒系にしか、溶けない蛋白であるプロラミンが蓄え CTB単品をそれぞれマウスに経口免疫して，血 PB-I)があるが，免疫積している l型蛋白常蔵体 ( 清中の抗原特異的 IgG抗体および糞便中の抗原特電顕法により MucoRiceの眠乳細胞内の CTB局在を異的粘膜 IgA抗体を測定すると，血清r:tの抗原特兵調べたところ，その両方の蛍白貯蔵体に発現・蓄積的 IgG抗体は，荊者とも免疫した CTB量に依存しされていた.また宵の消化酵素として知られているて同レベルの抗原特呉的抗体も誘導された.一方， .8でコメ粉末と反応させた試験管ペプシンを pH 1 抗原特異的粘膜 IgA抗体価は MucoRiceCTBの方が内の実験から 2型蛋白貯蔵体に存在するグ、ノレテリン組換え CTBに比較して有意に器濃度のワクチン投はこの条件下で 90%以上分解されるのに対し， 1型与で有効なレベルの抗原特異的 IgA抗体誘導が可蜜自貯蔵体に存在するプロラミンはほとんど分解能であった.さらに MucoRiceCTBを経口免疫したを受けず， CTB も 25%程度しか分解を受けていなマウスはコレラ毒素で攻撃された場合でも下痢をかった.この分解した CTBは 2型蛋白貯蔵体に存発症しなったが， CTBを発現していない米を投与さ在しているものと考えられ，大半は l型蛋白貯蔵体れたマウス群は下痢を発症し，腸管から回収されたイネ匹乳細胞内のワクチン発現製剤化ワクチン抗原コレラインフノレエンザロタウイルス … ￨MucoRice™I 関2 コメ型経口ワクチンの概念 4 9 挙イ也.イネ種子を基盤とする経口ワクチン MucoRiceの開発水分量も有意に多かった.さらに，こうして得られ剤化(錠斉1 ]，散剤，カプセノレイりされる. MucoRice 2 5C) 条件た MucoRiceを低温 WC) および常温 ( CTBの場合，現行では CTBとして約 1mgを含有下において 1 8カ月間乾燥状態で保存して，定期的するにその含有量および抗原特具的粘膜 IgA の誘導能ヒトでのワクチン効果が期待できると考えている. 0 MucoRiceCTB を 3~4 閉経口投与することで， 8カ月保存しでも含有量おを調べたところ，常温 1 5 . おわりによび IgA抗体誘導能とも，低温保存群に比較してまったく遜生なかった (Nochi ら 2 007) . 以上，この米型経口ワクチン MucoRiceは他の植コメにワクチン抗原を発現させることで，消化酵素耐性を付与し，粘膜免疫の誘導に有利な特性を持物生産型ワクチンを含む既存の粘膜ワクチンに比ち，常温で長期安定な経口ワクチンべて実用上多くの利点がある.米型ワクチンは常温発する理論・技術基盤の確立した.今後，選択マーで長期安定であり，消化酵素に対して耐性が付与さカーとして使用しているハイグロマイシン耐性遺れ，経口投与された場合に，効果的に発現ワクチン伝子を取り除いたマーカーフリー担ucoRice の顎発抗原を腸管関連リンパ総織に送達することにより，などが課題となる.加えて，実用化の面では組換え抗原特異的中和抗体を誘導することができる.つまイネの栽培環境および発現ワクチン最の変動を極り，冷蔵・注射器・注射針不婆ワクチンと使えるこ力抑えるために，完全また特定網室型閉鎖系での分とになるのである. 子農業工場の実用化が次なる課題である.これに闘 4 . コメ型ワクチンの栽培と製剤化遺伝子組換え米である MucoRiceを開しては，現在千葉大学園芸学部などとの共同研究によりその実用化に取り組んでいる. MucoRiceは，現行ではグワクチン発現米を医薬品として開発していくうロースチャンパーやバイオトロンのような遺伝子えでは，発現されたワクチンの構造決定，定量法な組換え施設内で栽場されている.実際の栽培・製造どの規格および試験法の確立，それを用いた安全性には完全罰鎖型か太陽光併用型の半閉鎖型栽培施試験，安定性試験などの実施がヒト臨床試験を含む設で行われる.実際，北海道産業総合研究所には完トランスレーショナルリサーチに持っていくうえ全閉鎖型の栽培施設が稼動している.温度と光(蛍で重要な課題となる. 文献たは高圧はトリウムランプなど)を制調するほか， J:湿度，空調，さらに可能であれば COzを制御した水耕栽培方式の閉鎖栽培施設で、ある.元来，イネはトウモロコシなどに比べ，花粉の飛散はほとんどなく，一般にいわれているような花粉の飛散で環境を汚染するものではないが，閉鎖系であればこの H i e i，Y .，S .O h t a，T . Komari a n dT .K u m a s h i r o1 9 9 4 .E f f i c i e n t zν ' a L . ) m e d i a t e d b y t r a n s f o r m a t i o n o f r i c e (Olyza αt A g r o b a c t e r i u ma n ds e q u e n c ea n a l y s i so ft h eb o u n d a r i e so ft h e l a n t J .6 : 2 7 1 2 8 2 TDNA.P N o c h i， T .， H .T a k a g i， Y .Yuki， L .Yang， T .Masumura， M.M叩 ma， U . N a k a n i s h i，A. Matsumura，A. Uozumi，T .H i r o i，S .M o r i t a ，K. T a n a k a，F .T a k a i w aa n dH . Kiyono 2 0 0 7 .R i c eb a s e dm u c o s a l h a i n -a n dn e e d l e f r e e v a c c i n ea s ag l o b a ls t r a t e g yf o rc o l dc lA c a d .S c . iUSA.1 0 4・1 0 9 8 6 …1 0 9 91 . v a c c i n a t i o n .P r o c .N a t. S t r e a t f i e l d， S ， . JJ .M.J i l k a， E . E .Hood， D . D .T u r n e r ， M.R.B a i l e y， J . M . ， S .L .Woodard， K. K .B e i f u s s， M . E .Horn， D . E .D e l a n e y， I .R Mayor てd 2 0 0 1 .P l a n t b a s e dv a c c i n e s :u n i q u e T i z a r da n dJ . A . Howa 2 7 4 2 2 7 4 8 . a d v a n t a g e s .V a c c i n e1 9・ Varmus， H .， R .K l a u s n e r ， E .Z e r h o u n i， T .A c h a r γ a， A . S .Daara n dP . A . S i n g e r2 0 0 3 .P u b l i ch e a l t h .G r a n dC h a l l e n g e si nG l o b a lH e a l t h S c i e n c e3 0 2 :3 9 8 3 9 9 . Y .a n dH .Kiyono 2 0 0 3 .Newg e n e r a t i o no f m u c o s a la d j u v a n t sf o r Yuki， l t h e i n d u c t i o n o fp r o t e c t i v e i m m u n i t y . R e v . Med. V i r o. 1 3 : 2 9 3 3 1 0 . Yuki， Y .，T .N o c h ia n dH .Kiyono2 0 0 7 .P r o g r e s sT o w a r d sa nAIDS M u c o s a lV a c c i n e :AnO v e r v i e wT u b e r c u l o s i s .8 7 :S 3 5 4 4 陶回句問題は完全に解決される.実は，潤鎖栽培施設での MucoRice の栽情は環境問題が主な理由ではない. 栽培環境を制御することで，①ワクチンの発現蓄積量を一定かっ最大にで、きること，②医薬品としての MucoRice の安全性を水耕栽培方式で担保すること， e年 3回程度に栽埼の効率を上げることにある.つまり， MucoRice の栽培は単なる農業というよりも分子農業工場に他ならない. 栽培された MucoRiceは玄米からアリユーロン層を除いた精米の工程を経て，粉末化され，涼薬，製