287 聖マリアンナ医科大学雑誌学会記事 Vol. 42, pp. 287–291, 2015 平成 25 年度学内研究助成金実績報告書研究課題名 Plk1 過剰発現と合成致死性抗癌剤の感受性研究者名佐藤工所属応用分子腫瘍学・助教【目的】 PLK1 過剰発現は多くの癌で散見され，そのほとんどが予後不良と関連がある。この PLK1 過剰発現癌を選択的に死滅させることができれば，多くの癌で予後不良癌を理論上副作用なしで効果的に治療することが可能となる。申請者らは PLK1 過剰発現が家族性乳癌の原因遺伝子 BRCA1 の酵素活性を抑制することを発見した。また合成致死に基づく新規抗癌剤 PARP 阻害剤が BRCA1 の酵素活性を失った細胞を選択的に死滅させることを発見した。これらの発見より PLK1 過剰発現を伴う予後不良癌は PARP 阻害剤により選択的に死滅させられるという仮説をたて検証した。【方法】 PLK1 発現量の低い細胞を用い PLK1 を恒常的に過剰発現する細胞株を作成し， PLK1 過剰発現細胞が PARP 阻害剤に高い感受性を示すか検討する。 ② 20 種類の癌細胞株を用い PLK1 発現量と PARP 阻害剤に対する感受性の関連を検討する。 ③ 20 種類の癌細胞株を免疫不全動物の皮下に接種し xenograft を作成し，PLK1 発現量と in vivo での PARP ① 阻害剤に対する感受性の関連を検討する。卵巣癌摘出検体を用い PLK1 発現量と PARP 阻害剤に対する感受性の関連を検討する。 ④ 【結果】上記の全ての実験で PLK1 過剰発現を伴う癌細胞は PARP 阻害剤に高い感受性を示すという仮説を支持する結果を得た。【考察】今回得られた結果から， PLK1 過剰発現を伴う予後不良癌は PARP 阻害剤にて選択的に死滅することがわかった。この発見により，これまで予後不良のバイオマーカーとされていた PLK1 の過剰発現が，新規抗癌剤により理論上副作用を伴わず，効果的な治療の対照となる可能性を示唆する。今後はさらに症例数を増やし検討すると同時に， PLK1 過剰発現が PARP 阻害剤に高い感受性を示す詳細なメカニズムを検討していく予定である。【結語】 PLK1 過剰発現を伴う予後不良癌は新規抗癌剤 PARP 阻害剤による効果的治療の対照となりうる。 97 288 研究課題名 C 型慢性肝炎治療効果予測診断の構築研究者名池田裕喜所属内科学（消化器・肝臓内科）・助教【目的】 C 型慢性肝炎に対する Peg-IFN/RBV 併用療法の治療効果に IL28B 遺伝子の SNP が強く関連している。しかし，治療感受性のある IL28B 遺伝子メジャーアレル（MjA）全例が治療成功となるわけではない。本研究は， IL28B 遺伝子 MjA における治療抵抗要因がヒストン修飾による IL28B 遺伝子不活化であることを検証するものである。【方法】 ① IL28B 遺伝子のエピジェネティックな異常が遺伝子配列上存在し得るかを GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38/ 2013 年度版をもとに検証する。② 複数細胞株における IL28B 遺伝子の発現レベル差を検証し，Direct sequencing 法にて IL28B 遺伝子の SNP を同定する。そして，ヒストン H3K4Ac, H3K9Me2, H3K27Me3 修飾を，それぞれクロマチン免疫沈降（ChIP）解析により行う。 ③ 臨床サンプルの IL28B 遺伝子発現解析，SNP 解析，ヒストン修飾解析を行う。【結果】 GRCh38/hg38 における解析結果より， IL28B 遺伝子プロモーター領域には CpG island を認めず，遺伝子発現の不活化に DNA メチル化の関与は考えにくいことが判明した。一方で Affymetrix Human Exon 1.0 ST arrays による検索では，ヒト肝臓組織において中等度の発現を示すことが判明した。複数細胞株の検討では，各種細胞株を培養し，RNA 抽出・cDNA 変換の後，RealtimePCR 法にて遺伝子発現を半定量解析とした。結果は肝臓がん細胞株 3 種においても，大きな遺伝子発現レベルに差があることが判明した。【考察】 IL28B MjA の治療抵抗要因として IL28B 遺伝子の発現レベルが症例間で大きく異なることが推測されている。GRCh38/hg38 における解析結果は，IL28B 遺伝子発現の不活化にヒストン修飾が深く関与している可能性を示唆している。本研究の仮説が明らかとなれば，より精度の高い治療効果予測が可能となり個別化治療の一助になると思われる。【結語】この解析結果をもとに，細胞株における IL28B の SNP 解析・ヒストン修飾解析を行う。そして臨床サンプルを用いて IL28B 遺伝子発現不活化と治療成績との関連に関して検討を行う予定である。 98 289 研究課題名移植腎の長期予後を左右する尿細管炎の存在とマトリックスメタロプロテアーゼの役割研究者名北島和樹所属腎泌尿器外科学・助教【目的】移植腎組織の障害は，修復・再生して回復する場合と，線維化の進行により機能不全に至る場合がある。本 -9 研究では，移植腎の予後（回復か線維化か）を決定づける過程でのマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）と炎症細胞の関与について検討した。【方法】免疫原の異なる 4 種類の抗 MMP-9 抗体を用いてマウス片側腎結紮（UUO）モデル（術後 1・3・7・14 日）の腎および移植腎生検（急性拒絶，急性 CNI 腎症）組織を免疫染色した。また各種組織マーカー（E-cadherin, Vimentin, -catenin, α-SMA 他）抗体を用いて線維化の進行を免疫組織学的に評価した。さらに腎移植患者の尿（術前，術後 1・2・4・7・14 日）を用いたマルチプレックスアッセイにより尿中 MMP-1, 2, 9 と TIMP-1, 2 を定量した。【結果】 MMP-9 の N 末端配列を免疫原とする抗体（92 k Da 潜在性 proMMP-9 のみを認識）は，その他の抗体（proMMP-9 と 84 k Da 活性型 MMP-9 の両方を認識）と異なる免疫染色性を示した。 proMMP-9 はマウス UUO モデルにおいては健常な近位尿細管上皮（PT）に発現（＋）し，尿細管障害の進行に伴って発現が低下した（±/−）。移植腎生検では，proMMP-9 は CNI 腎症において強発現（＋＋）し，急性拒絶では発現が低下（±/−）していた。一方，活性型 MMP-9 の発現は，各種抗体による免疫染色性の比較から， CNI 腎症で低く，急性拒絶とくに尿細管炎（T 細胞浸潤）を伴い，線維化が進行し始めた組織で強く持続的に発現していることが示された。腎移植患者の尿中 MMP-9 レベルは，腎移植後の炎症性変化に伴って上昇する傾向を示した。【考察】我々はこれまでに，1）移植腎が損傷を受けると，直後に PT で MMP-9 の発現が増強し，2）CNI などの一過性の急性尿細管障害では症状が回復すると MMP-9 の発現が低下する（可逆的な発現増強）のに対し，急性拒絶では病理所見や臨床症状が改善しても MMP-9 の強い発現が持続する（非可逆的な発現増強）ことを報告した。今回の結果は，回復可能な尿細管障害では定常的な proMMP-9 の発現が一過性に増強するのに対し，急性拒絶では活性型 MMP-9 が強発現し，その持続発現と線維化の進行に炎症細胞の PT 内への浸潤が関与している可能性が示唆された。【結語】尿細管上皮における潜在性 proMMP-9 と活性型 MMP-9 の発現を識別することは，移植腎の予後を予測する有用な情報になると考えられる。 99 290 研究課題名 iPS 細胞由来神経細胞移植による脳損傷運動障害回復におけるケモカイン制御研究者名有光なぎさ所属免疫学・病害動物学・助教【目的】脳損傷での神経細胞死への新規治療法として幹細胞由来神経細胞移植治療が示唆されている。そこで本研究では，ヒト induced pluripotent stem cell（hiPS 細胞）をはじめとする幹細胞由来神経分化細胞移植の有効性を明らかにするとともに，神経分化機構と移植後の神経再生における制御機構の解明と有効な治療法の確立を目指し，脳損傷マウスへの細胞移植実験を行った。【方法】 hiPS 細胞を培養皿から解離した後，分化刺激として bFGF 除去培地にて， 4 日間浮遊培養し胚様細胞塊（embryoid body: EB）を作製する。次に EB をフィブロネクチンコート培養皿に播種し，24，48 時間後に分化培地（レチノイン酸，ノジン，ソニックヘッジホック含む）にて刺激を与えた後，凍結損傷による片マヒモデルマウスの線条体位に細胞移植を行った。分化細胞の一部は経時的回収もしくは固定後，遺伝子発現を解析した。運動機能の評価系として，Rota-rod 法，beam walking 試験を用いた。また，分化細胞と移植神経細胞の性質について組織免疫染色法により調べた。【結果】 hiPS 細胞を分化誘導した結果，神経マーカーや運動神経マーカーの発現を RT-PCR 及び免疫染色にて確認できた。そこで，作製した分化誘導神経細胞を損傷したマウスに移植し機能回復を解析した。その結果，移植マウスにおいて移植約 1 週間後以降，優位に運動機能の改善が見られた。マウス脳切片に対して病理学的評価を行ったところ，損傷部位において移植細胞が運動神経として定着していた。さらに，損傷，移植と関連してケモカイン，接着因子の発現がみられた。【考察】 hiPS 細胞由来神経細胞移植は片マヒ症状改善に効果があると考えられる。また，損傷部から遊走促進に関わるケモカイン SDF1 の産生と，その受容体 CXCR4 と接着因子 NCAM を選択的に発現した分化誘導神経細胞がマウス神経回路内に見られたことから移植神経細胞が組織への定着及び再生に関与する事が考えられる。【結語】移植実験においてケモカイン SDF1 及び細胞接着因子は細胞遊走や組織内での再生に重要な役割を担っている事が示唆される。また，神経細胞や脳の発達過程において発現する事が知られている他ケモカインとの相互作用について今後検討する必要があると考えている。 100 291 研究課題名 EGFR 抑制と DNA 相同組換え修復不全による合成致死性の解析研究者名セドキーナアンナ所属応用分子腫瘍学・研究技術員【目的】乳癌において家族性乳癌の原因遺伝子 BRCA1 の変異，または機能抑制は予後不良の乳癌，Basal-like 乳癌の発生におおいに関連がある。このため BRCA1 不全乳癌（予後不良乳癌）の効果的治療の開発が重要である。近年， PARP 阻害剤が BRCA1 機能不全を伴う癌細胞のみを選択的に死滅させる画期的な治療薬となりうるという報告があり注目されている。実際に PARP 阻害剤は臨床試験でも phase 2 まで行われ有望な結果を示している。しかし癌細胞は PARP 阻害剤に対し耐性を獲得することが報告され，次なる BRCA1 不全癌の効果的治療の開発が待たれる。申請者は BRCA1 機能不全が DNA 二本鎖切断修復機構のうち Homologous Recombination（HR）不全をおこすことに注目し，もう一つの修復機構である Non-homologous End Joining （NHEJ）を抑制することで BRCA1 機能不全を伴う細胞（癌細胞）のみ DNA 修復不全をおこし細胞死するという仮説をたて検証した。【方法】モデル細胞として BRCA1 機能不全を伴う卵巣癌細胞株（UWB1. 289）を用いた。対照として UWB1. 289 に野生型 BRCA1 を恒常的に発現する細胞株（UWB1. 289＋BRCA1）を用いた。単一の細胞株で得られた結果は，他の細胞株を用いた実験での再現性も検討する必要がある。そこで BRCA1 機能不全を伴う乳癌細胞株（HCC1937）に野生型 BRCA1 を恒常的に発現する細胞株（HCC1937＋BRCA1）の樹立をめざした。 NHEJ を抑制する方法として，非小細胞肺癌の治療薬として既に臨床で用いられている Erlotinib が核内 EGFR の抑制を介して NHEJ を抑制するという機能を利用した。UWB1. 289 を用い，BRCA1 機能不全細胞が Erlotinib に高い感受性を示すか検討した。また，同様の結果が HCC1937 を用いた実験で再現できるか検討した。【結果】 HCC1937 を用い野生型 BRCA1 を恒常的に発現する細胞株の樹立に成功した。 UWB1.289 を用いた実験で BRCA1 機能不全細胞は BRCA1 正常細胞に比べ高い感受性を示すことを確認した。この結果は HCC1937 を用いた実験で再現性を得られた。【考察】 BRCA1 機能不全を伴う癌は NHEJ の亢進を伴っており，その抑制にて死滅する可能性がある。これは今後，実験動物を用いた実験での再現性を確認する必要がある。また実際に実験に用いた細胞で， BRCA1 機能不全細胞では HR が抑制され NHEJ が亢進していること，Erlotinib 投与にて NHEJ も抑制されていることを証明する必要があると考えられる。これは Dr. Pablo Huertasu（Spain）との共同研究にて進行中である。【結語】 BRCA1 機能不全を伴う予後不良乳癌に対し Erlotinib が効果的治療薬となり得る。 101