7 コラーゲン遺伝子改変と動物の疾患モデル二宮喜文岡山大学医学部分子医化学はじめにコラーゲンは生体に最も豊富に存在するタンパク 1.コラーゲンスーパーファミリーコラーゲン遺伝子は現在 19種類明らかになってである｡からだの表面に存在し機械的な力や感染から体を防御したり､炎症の場を提供している一方､骨格系に存在して重力を保持するための機能を果たしたり､ある種の細胞の増殖を制御したりしていることが明らかになってきている｡本日は､コラーゲンが骨格系の機能に関係していることから､外見上その異常に気がつきやすいいくつかのコラーゲン遺伝子異常のなかで､その病因との関係が判明してきた動物の疾患モデル例を紹介してみたい｡ 1)｡これらはコラーゲンタンパクとしいる ( 表 1)( ての構造､代謝､高分子会合体様式等がわかっているだけでなく､これらのコラーゲンタンパクをコードする遺伝子の構造や発現様式も､いくつかの例外を除いて殆どわかってきている｡そのほかに､コラーゲン様構造をもっているがコラーゲンという範暗にはいらないポリペプチドがたくさんわかってきて l q､マンノース結合タンパク､いる｡たとえば､c コングルチニン､スカベンジャー受容体､サーファクタント､MARCOなど｡表 1 コラーゲンの分類 1)フィブリル形成コラーゲン Ⅰ型 :coLIAl,COLIA2 11型 :coL2A1 1日型 :coL3AI V型 :coL5Al,COL5A2,COL5A3 * xl型 : co ll A l,COLll A 2 (COL l lA ) L 3 2)プアシット ( FACI T) コラーゲン I X型 : coL9Al,COL9 2 ,COL9A3 xIJ型 :coL12AI xl V型 :coL14AI xvI型 :coL16AI XI X型 :coL19Al A 3)基底膜型コラーゲン l V型 : cc I L4Al,COL4A2, COL4A3 COL4A 4 , COL4 A 5 , , COL4A6 4)短鎖コラーゲン X型 :COLIOAI Vlll型 :coL8AL COL8A2 5)マルチプレキシンコラーゲン xv型 :coL15AI xvllI型 :coL18Al 6)その他のコラーゲン ⅤⅠ型 : coL6Al,COL6A2,COL6A 3 V王Ⅰ型 :coL7Al , XIll型 :coL13AI xvII型 :coL17Al Xl )鎖はCO L2Alの産物 α1( Ⅱ) 鎖の * c oLll A3の翻訳産物である α3( 翻訳後の修飾の違いによるものである O 8 図 1 コラーゲン遺伝子の染色体上の位置ヒトコラーゲン遺伝子の染色体上の位置を示したO 現在 19型コラーゲンをコードする 33 遺伝子のうち､図に示すように 3 1遺伝子について位置が確認されている o CO L 5 A3と c oL 1 4 Alについては確認されていないO 興味あることに､いくつかの遺伝子が同じl o c u sに存在しているようであるO例えば､染色体 1番､ 2番､ 6番､ 21番などがそれであるoお互 Ⅴ型コラーゲンの 6遺伝子以外は未だ殆ど調べられていないo いの詳細な位置関係はⅠ 2.コラーゲン遺伝子コラーゲン遺伝子は､染色体上のさまざまな位置に散らばって存在している ( 図 1)｡面白いのは染色体上の位置が全く異なる二つの遺伝子産物が､常に 2 :1で転写生合成されている例 (Ⅰ型コラーゲンはその典型例)があったり＼同じ遺伝子座に隣接して存在するコラーゲン遺伝子 ( 例えば､c o L 4 A lと c o L 4 A 2は染色体 1 3 番に､C O L 4 A3とc o L 4A 4は染色体 2 番に､C O L4 A 5とc o L 4 A 6は染色体xにおいて共通のプロモーターを介して反対向きに並んでいる｡) も存在するし､また他のコラーゲン以外の遺伝子とほん 00bpはなれて､縦列しているコラーゲン遺伝子の5 o L l l A 2 遺伝子)｡もある ( 例 :c 3.コラーゲンの生合成 yⅩ一 Yの特異的なアミノ酸配コラーゲン α鎖はGl 列の繰り返し構造を有する｡このコラーゲンポリペプチド鎖が 3本よりあわきって三重へリックス構造を呈するコラーゲン分子を形成するさらに細胞外で高分子会合体を形成して､他のマトリックス分子や細胞等と相互作用し生物学的機能を果たす｡蛋白としてのコラーゲンの特徴の一つにコラーゲン生合成過程があるコラーゲンもしくはコラーゲン棟構造を有するポリペプチドは翻訳後の多くの修飾を受けることが主に Ⅰ型を使った実験より実証されている. 3細胞内では 3種類の水酸化酵素や 2種類の糖転化酵素により修飾された α鎖は三本鎖ヘリックスを巻いて分子を形成する｡細胞外に分泌される時､フィブリル形成コラーゲンではN末端やC末端を特異的に切断するペプチターゼの働きによりプロコラーゲンから成熟したコラーゲン分子になる｡さらに細胞外では架橋形成により安定なコラーゲンフィブリルを形成したり､また他の分子と高分子会合体を形成したりする｡｡｡ 9 表 2 コラーゲン遺伝子異常によって生じた遺伝性結合織病疾患文献遺伝子 CO LI Al, CO LI A 2 CO LI A 2 CO LI Al, 骨そしょう症 , CO LI A 2 CO LI Al CO LI A2 軟骨無形成症 CO LI A 2 軟骨低形成症 CO LI A2 先天性骨幹端異形成症〔 l LI A 2 ストラドウイック型 ( 骨幹端異形成症) C CO LI A 2 Kni es t型異形成症 CO LI A 2 ステックラー症候群 CO LI A 2 変形性関節症 CO L3AI I V型エーラスダンロス症候群 CO L3 AI 家族性大動脈痛アルポート症候群 ( 常染色体劣性 ) CO L 4 A3, C O L 4A 4 CO L 4A 5 アルポート症候群 ( X 染色体性 ) rO L 4A 5十CO L4A 6 アルポート症候群十平滑筋症 CO L7AI 先天性表皮水泡症 ( 異栄養型) CO L9A2 多発性骨端骨異形成症 C OLI O AI シュミット型骨幹異形成症 C O L1 7 Al 先天性表皮水泡症 ( 結合型 ) 骨形成不全症 VI l 型エーラスダンロス症 S poti l a他 pr o NAS88, 5 42 3, 1 991 Bi ol . Che m.26 4,1 82 65,1 9 89 Vi s si ng他 J. Ho rt o n他 pr o NAS83, 45 83, 1 99 2 他 pr o NAS87, 6565 ,1 99 0 Al a Ko kko Le e他 s ci e nce2 4 4, 978,1 9 8 9 A h ma d他 A m.∫. H um.Ge net52. 39,1 99 3 Tro m p他 J. Bi ol . Che m.26 4.1 9 31 3,1 9 89 Tr o mp他 J. Bi ol. Che m.26 4.1 9 31 3,1 9 89 他 J. Cli n.∫ n vest .86, 1 465,1 99 0 Ko nt us aari 他 NatureGenet3,323,1993 Wi nt e r pac ht Fes sl er他 pr o NA91, 50 70, 1 99 4 他 Nat ureGe net8, 1 29,1 99 4 Ros ati ureGe net8, 77,1 99 4 Moc hi z u ki他 Nat Tr ygg vas o n他 Ki dne yl nt .43, 38,1 99 3 Z ho u他 S ci e nce261, 11 6 7,1 99 3 ureG e net4, 62, 1 9 9 3 C hri s ti a no他 Nat n Nat u1 cce net1 2,L OB,1 99 6 N l ur a ga ki War ma n他 Nat ur eGe net5, 7 9,1 99 3 Mc Gra【 h他 A m.J. Pat hol .1 48,1 7 87, 1 9 9 6 ( C57BL/6Fr SeCho/+x MEV)x( C57BL/6Fr SeCho/+x L o c u s D3Mi t 5 4 c h o L OD 0. 1 5 . ∼ 1 6. 0 7 2 7. 5 27. D3Mi t 1 7 2. 9＼ MEV) Ge n e s L o c a t i o n so fh u ma nh o mo l o g u e s H s b 3 b 1 plトp1 3 G j a 5 Z, At pl al ,Amp dl C d Cd 53 Ng f b , ‖r a s ,Ts h b ,R a pl a Z,K c n a 3 K c n a Gn a t Z , Gn a t 3 nalィS3 K c Cs t m Amyl , AmyZ , Co l l1 al C f 3 1 p1 3 , 1 p1 3 1 p1 3, 1 p1 3,1 p1 3,1 p1 3,1 p1 2 p1 3 .1 p1 3 1 p1 321 1 p 21 ,1 p 21 ,1 p 21 1 pZ2 p 21 図2 C h o マウスの連鎖解析結果 (5) F2交配によるマウス染色体 3 番上の C hoマウスの連鎖解析 4 .コラーゲン遺伝子異常によって生じる疾患コラーゲン遺伝子異常によって生じる疾患として現在までに明らかにされているものをまとめた ( 秦 2)(2･3)｡その多くは表現系として骨格や軟骨形成異常を伴うものが多く明らかに先天異常として認識されるものが多い｡そのほか､コラーゲン遺伝子が臓器や組織特異的に発現していることから､ある臓器の障害として認識されるコラーゲン遺伝子病も存 o L 4 A 3､在する例えばアルポート症候群は､c c o L 4 A 4､C O L 4 A5 遺伝子異常によって､基底膜の構造｡異常を呈して､腎臓における血液成分から尿をつくる重要なフィルター機能障害に至る進行性糸球体腎炎の例として最近明らかになった｡未だわかっていない遺伝性疾患のうちコラーゲン遺伝子異常であるものが将来多く見つかってくるであろう｡ 1 0 COLLAGEN COMPONENTSOFCARTI LAGE FI BRI LS ( ド) L S P KK TRRH T E Sl QA i i E欝 ■ ESi ■ l nt er act l onwi t hpr ot oogl ycans? T YP∈"COLUI G∈N 図3軟骨フィブリルとx 工コラーゲン( 5 ) 軟骨フィブリルはフィブリル形成コラーゲンであるⅠⅠ 型､xI型コラーゲンと､FACI Tコラー Xコラーゲンから成る｡I Xコラーゲンはフィブリルの表面に位置するが､XI型コゲンであるI ラーゲンは軟骨フィブリルの中に一部埋もれたように存在するOアミノ酸配列を示した部位は､特異的抗体の抗原として用いた部位である｡ 5 .動物の疾患モデルとして見つかったコラーゲ 6 .コラーゲン遺伝子改変動物の応用ン遺伝子異常の例トランスジェ-ニックマウスは 1)コラーゲン遺伝子の変異により起きてくる疾患がどのようにして生じるかの機序の解明に貢献してきた｡さらにコラユタ州 provoのSeegmiller教授は､実験動物を観察していて､マウスの常染色体劣性の軟骨形成不全症を発見した〔 4 )｡これはc h oと名付けられた｡ heterozygousで､四肢､肋骨､下顎骨､気管支に異常が来て生後間もなく死亡するものであった｡ c ho / c hoの新生マウスの四肢骨は骨幹部が正常マウスのそれより広いが､長さは半分程度であった｡ seegmiH er教授は軟骨に存在する多くのマトリックス遺伝子､例えば l I 型コラーゲン､アグリカン､ I X 型コラーゲン遺伝子など多くの遺伝子を調べたが､調べた遺伝子からは原因遺伝子らしい陽性の事実は見つからなかった｡そこで正攻法で､ハーバード大学の 01sen研究室と私共の研究室は c ho 遺伝子の連鎖解析を行なってみると､染色体 3番にマップされそこに存在する α1( ⅩⅠ )遺伝子であるC O L l l A lと同じ 5 )0 c ho マウスのC O L l l A l 遺位置であった｡ ( 図 2)( 伝子を検索すると､翻訳開始コドンから 5 7 0ヌクレオチド下流のシチジン塩基の欠損が見つかり､このことがフレームシフトとなり､直ちに終止コドンを型コ生んでしまうのである｡このことによって､ⅩⅠ ラーゲンは軟骨におけるコラーゲンフィブリルの形成には必須であることがわかった｡つまり､軟骨の Ⅰ 型､ Ⅰ Ⅹ型､ⅩⅠ 型コラーゲコラーゲンフィブリルは Ⅰ ンから成ることがわかっていた ( 図 3の如く)が､XI 型コラーゲンが､そのフィブリル形成に必須であることがはじめて明らかになったのである正常の軟｡骨分イヒと組織形成には､ⅩⅠ 型コラーゲンの存在､とくにそのコラーゲン三本鎖構造を形成するためには C 末端のN C lドメイン､そのなかでもシステイン残基が重要であることが判明したのである｡ーゲン分子もしくはその各ドメインの生物学的機能の解析に使用できる｡ 2) さらに未だわかっていないコラーゲン遺伝子変異がひき起こす疾患の同定をするためには格好の道具であると思われる｡ 3)また種々のヒト疾患のモデルとなりこれを用いた治療の開発に大きく貢献するであろう｡現在まで例として､コラーゲン遺伝子改変によってコラーゲンの機能を明らかにしようとした実験として : c oll alM ov1 3マウス- 完全に α 1( I ) 遺伝子に発現が停止する｡しかしマウス胎児は1 3日目まで生き延びるが､大血管の破裂によって死亡する( 6 )0 co1 2al変異体大量発現 ( 7 )-c ho ndrodys pl asi a 8 )-脊椎､皮膚､眼に異常 co1 5a2変異体大量発現 ( co1 9al 変異体大量発現 ( 9) -o st eoart hrosi s棟 co1 9alノックアウトマウス ( 1 0 ) -oste oart hrosi s 棟 c o1 l Oal 変異体大量発現 ( ll ) -s pond yl oe pi ph yseal dys pl asi a coll Oal ノックアウトマウス ( 1 2 )-形質変化は特に認められていない｡ co1 4a3ノックアウトマウス ( 1 3 ･ 1 4 )-アルポート症候群が現在報告され解析が進められている｡このように､実験動物モデルは､各種疾患のモデルとして､その病因の解析に用いられるだけでなく､遺伝子の機能､タンパク分子の会合体の解析や機能の解析にも用いられる｡特に細胞外マトリックス分子の場合には､その遺伝子異常は骨格系を中心に､外から形質の異常を発見することが比較的簡単であるので､ノックアウトマウスの実験など積極的に遺 11 伝子発現を破壊する実験には適している多くのコラーゲン遺伝子のノックアウトマウスもしくは｡ I ) o mi na ntne gati vemut ati o nを作成して､コラーゲン分子が作る正常の高分子会合体構築を撹乱したときにどのような形質変化が生じるかを観察することによって､コラーゲン遺伝子の機能を検索する試みが世界中の研究室でなされている｡これらの遺伝子の生物学的機能がはっきりするのはそう遠いことではないであろう｡ References 1 ) 01 s e nB. 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