微生物の利用

微生物学２
微生物の利用
微生物による医薬品の製造
抗生物質と化学療法薬
抗生物質
微生物によって生産される抗微生物物質（狭義）
微生物によって生産される化学療法薬（広義）
化学療法薬
微生物あるいはがん細胞に対して，その発育や増殖を阻止し，
あるいは死滅させる作用のある化学物質
ペニシリン系抗生物質
O
H
H
H
S
N
H
N
CH3
CH3
O
COOH
ペニシリンGの発酵
Penicillium chrysogenum
7 g/L
E. coli
ペニシリン
アシラーゼ
H
S
H2N
N
CH3
CH3
O
COOH
6-アミノペニシラン酸
（6-APA）
化学変換
アンピシリン
アモキシシリン etc.
セフェム系抗生物質
NH2
HOOC
O
H
H
N
H
H
S
N
Pseudomonas sp.
COOH
セファロスポリンC
Acremonium chrysogenum
H2N
S
N
OCOCH3
O
H
OCOCH3
O
セファロスポリン
アシラーゼ
COOH
7-アミノセファロスポラン酸
（7-ACA）
化学変換
セフカペンピボキシル
セフジトレンピボキシル etc.
マクロライド系抗生物質
O
H3C
CH3
HO
OH
OH
H3C
H3C
CH3
HO
O
H3C
O
O
H3C
N
O
CH3
CH3
OCH3
O
CH3
CH3
OH
O
CH3
エリスロマイシン
Saccharopolyspora erythraea
化学変換
クラリスロマイシン
アジスロマイシン
抗真菌抗生物質
OH
H3C
HO
OH
O
O
CH3
OH
OH
OH
OH
OH
O
H
H3C
H3C
HO
H2N
OH
O
COOH
O
アムホテリシンB
Streptomyces nodosus
深在性真菌感染症（注射）
細胞膜エルゴステロールと結合し，細胞膜機能を障害
抗真菌抗生物質
OH
O
HO
OH
O
H
H
N
H2N
NH
H
N
O
O
H3C
HO
H
O
HO
O
CH3
HO
H
OH
N
HN
HO
OH
Streptomyces sp.
アシラーゼ
H2N
H
N
O
H3C
CH3
H
NH
O
O
O
HO
O
H
OH
WF11899A
Coleophoma empetri
O
HO
OH
O
H
H
N
H2N
H
N
O
H3C
O
H
HO
NH
O
HN
HO
O
HO
O
H
N
CH3
OH
ミカファンギン
NH
O
O
OH
N
H
NH
OH
H
O
O
SO3Na
OH
N
HN
NH
O
OH
H
H
NH
HO
H3C
H
O
HO
OH
O
H
N
OH
H
H
NH
SO3Na
O
O
O
OH
NH2
OH
CH3
SO3Na
抗腫瘍抗生物質
NH2
H H
N
H2NCO
N
CONH2
N
O
CH3 HN
O
OH
O
H
O
HO
H H
N
O
CH3 HO
N
H
O
N
N
H
R
S
S
CH3
N
H
ブレオマイシン
N
H
O
OH
N
CH3
H2N
HO
O
OH
O
Streptomyces verticillus
OH
OH
O
CONH2
皮膚がんなどの扁平上皮がん（注射，外用）
作用機序：DNA鎖切断
抗腫瘍抗生物質
O
OH
OH
OCH3 O
OH
H3C
OH
O
O
O
H
O
NH2
ダウノルビシン
Streptomyces peucetius
急性白血病（注射）
OH
O
CH3
OH
OCH3 O
OH
H3C
OH
O
CH2OH
H
O
NH2
ドキソルビシン
Streptomyces peucetius
悪性リンパ腫，肺がん，消化器がん，
乳がん，膀胱がん，骨肉腫（注射）
アントラサイクリン系抗生物質
DNAインターカレーター（塩基対の間に挿入）
免疫抑制薬
Me
Me
Me
Me
Me
N
Me
N
O
Me
N
Me
Me
O
O
O
HO
Me
Me
Me
Me
Me
H
N
N
Me
H
N
N
H
Me
O
H
H3C
シクロスポリン
Trichoderma inflatum
O
OH
O
CH3
O
Me
Me
O
N
O
N
CH3
H3CO
Me
N
H
O
Me
O
O
H3CO
N
H
N
OH
Me
Me
O
O
H
O
Me
O
Me
CH3
CH3
タクロリムス
Streptomyces tsukubaensis
OCH3
OH
高脂血症治療薬
HO
OH
O
H3C
H
H3C
CH3
O
CH3
H
微生物変換
HO
ML-236B
プラバスタチン
Penicillium citrinum
HMG-CoA還元酵素阻害 → 血中コレステロール低下
COONa
OH
O
Streptomyces carbophilus
O
CH3
HO
COONa
CH3
微生物によるアミノ酸，核酸の製造
アミノ酸発酵
H2N
HOOC
COOH
COOH
NH2
NH2
L-グルタミン酸
Corynebacterium glutamicum
L-リシン
Corynebacterium glutamicum
OH
ビールは大麦から
味の素はサトウキビから
H3C
COOH
NH2
L-トレオニン
Brevibacterium flavum
核酸発酵
O
O
N
HN
N
N
H2N
HO
HO
O
HO
N
HN
N
N
O
OH
HO OH
イノシン
Corynebacterium ammoniagenes
グアノシン
Corynebacterium ammoniagenes
Morganella morganii
酸性ホスファターゼ
イノシン酸
（カツオ節の旨味成分）
グアニル酸
（シイタケの旨味成分）
微生物による糖類の製造
シクロデキストリンの製造
HO
O
O
O
OH HO
HO
O HO
HO
HO
デンプン
シクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ
O
HO
OH
内部：疎水性
外部：親水性
O
Bacillus stearothermophilus
O
HO
OH
OH
OH O
OH
OH
OH HO
O
O
O
OH
α-D-グルコース×6
α-D-グルコース×7
α-D-グルコース×8
O
αｰシクロデキストリン
βｰシクロデキストリン
γｰシクロデキストリン
発酵による多糖生産
多糖類
構成糖
発酵微生物
用途
デキストラン
α-1,6ｰグルカン
Leuconostoc
mesenteroides
血漿増量剤
クロマトグラフィー用樹脂
ヒアルロン酸
D-グルクロン酸
Streptococcus
N-アセチル-D-グルコサミン zooepidemicus
セルロース
β-1,4ｰグルカン
Acetobacter
xylinum
スピーカーの振動板
キサンタンガム
D-グルコース，
D-マンノース
D-グルクロン酸
Xanthomonas
campestris
アイスクリーム用増粘剤，
化粧品
化粧品，眼科手術補助剤，
整形外科用注射剤，
創傷の被覆剤
微生物酵素の利用
微生物酵素
酵素
生産菌
酵素反応
用途
アルカリプロテアーゼ
Bacillus licheniformis
タンパク質分解
洗剤
アルカリセルラーゼ
Bacillus sp.
セルロース分解
洗剤
リパーゼ
Thermomyces lanuginosus
脂質分解
洗剤
α-アミラーゼ
Bacillus licheniformis
デンプン加水分解
デンプン液化
β-アミラーゼ
Aspergillus oryzae
デンプン加水分解
マルトース製造
プルラナーゼ
Bacillus brevis
デンプン側鎖分解
マルトース製造
グルコアミラーゼ
Aspergillus niger
デンプン加水分解
グルコース製造
セルラーゼ
Trichoderma reesei
セルロース加水分解
食品加工，繊維処理
凝乳プロテアーゼ
Rhizomucor pusillus
凝乳
チーズ製造
微生物による食品の製造
食品製造と微生物
発酵
・微生物が嫌気条件下でエネルギーを得るために有機化合物を酸化して，
アルコール，有機酸，二酸化炭素などを生成する過程
・微生物を利用して食品や有機化合物を工業的に製造すること
醸造
発酵作用を利用してアルコール飲料や調味料などを製造すること
日本酒，ビール，醤油，味噌，酢
発酵食品と微生物
パン
小麦粉＋ Saccharomyces cerevisiae（パン酵母）
タンパク質 → アミノ酸（旨味）
デンプン → 二酸化炭素（ふくらみ）
納豆
煮大豆＋ Bacillus subtilis（枯草菌）
かつお節
茹で干したカツオの薫製＋ Aspergillus glaucus（コウジカビの仲間）
ぬか漬け
野菜類＋糠中のLactobacillus属細菌など
発酵食品と微生物
ヨーグルト・・・乳，脱脂乳の乳酸発酵
国際規格
Lactobacillus bulgaricus ＋ Streptococcus salivarius subsp. thermophilus
国内販売品
ナチュレ恵 Lactobacillus gasseri
プロビオヨーグルト Lactobacillus gasseri
ブルガリアヨーグルト Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Streptococcus thermophilus
ビヒダスヨーグルト Bifidobacterium longum
チーズ・・・乳を凝乳酵素で処理後，乳酸菌またはカビによる発酵
ゴーダ，チェダー Lactococcus lactis
カマンベール Penicillium candida
ゴルゴンゾーラ Penicillium glaucum
発酵食品と微生物
くさや
ムロアジ，トビウオなどをくさや液に浸して干す
Corynebacterium kusaya（くさや菌）
アンモニア，酪酸，吉草酸
鮒寿司
塩漬けしたフナに飯を詰め，嫌気的乳酸発酵
Lactobacillus属細菌
乳酸､蟻酸，酢酸，プロピオン酸
シュールストレミング
塩漬けしたニシンを発酵中に缶詰にする（殺菌しない）
Haloanaerobium属細菌（嫌気性菌）
酪酸，プロピオン酸，酢酸，硫化水素
醸造食品と微生物
日本酒
米のAspergillus oryzae（コウジカビ）による糖化，
Saccharomyces cerevisiaeによる発酵
ビール
オオムギの麦芽アミラーゼによる糖化，Saccharomyces cerevisiaeによる発酵
ワイン
ブドウ果汁のSaccharomyces cerevisiaeによる発酵
醤油
蒸煮大豆と割砕小麦のAspergillus sojaeによる発酵
味噌
Aspergillus oryzae酵素による煮大豆の分解，酵母，乳酸菌による発酵
酢
酒類のAcetobacter aceti（酢酸菌）による発酵（好気発酵）
遺伝子工学
遺伝子操作の手法
配列特異的DNA鎖切断
制限酵素
DNA鎖連結
DNAリガーゼ
3'末端への塩基付加
ターミナルデオキシリボヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（TdT）
DNA鎖複製
Taqポリメラーゼ（Thermus aquaticus）
逆転写
AMV (Avian Myeloblastosis Virus)-RT
MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)-RT
制限酵素
二本鎖DNAの特定の塩基配列を認識して切断する酵素
EcoRI
ＧＡＡＴＴＣ
ＣＴＴＡＡＧ
Escherichia coli由来
BamHI
ＧＧＡＴＣＣ
ＣＣＴＡＧＧ
Bacillus amyloliquefaciens由来
HindIII
ＡＡＧＣＴＴ
ＴＴＣＧＡＡ
Haemophilus influenzae由来
付着末端（cohesive end）が残る
XbaI
ＴＣＴＡＧＡ
ＡＧＡＴＣＴ
Xanthomonas badrii由来
KpnI
ＧＧＴＡＣＣ
ＣＣＡＴＧＧ
Klebsiella pneumoniae由来
HhaI
ＧＣＧＣ
ＣＧＣＧ
Haemophilus haemolyticus由来
NotI
ＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＣＧＣＣＧＧＣＧ
Nocardia otitidis-caviarum由来
付着末端（cohesive end）が残る
DraI
ＴＴＴＡＡＡ
ＡＡＡＴＴＴ
Deinococcus radiophilus由来
SmaI
ＣＣＣＧＧＧ
ＧＧＧＣＣＣ
Serratia marcescens由来
HincII
ＧＴＣＧＡＣ
ＣＡＧＣＴＧ
Haemophilus influenzae由来
ＧＴＴＡＡＣ
ＣＡＡＴＴＧ
平滑末端（blunt end）が残る
DNA分子の結合１
ＡＡＴＴ
ＴＴＡＡ
ＡＡＴＴ
ＴＴＡＡ
DNAリガーゼによる結合
DNAリガーゼによる結合
DNA分子の結合２
dGTP
ターミナルデオキシリボヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（TdT）による付加
ＧＧＧＧ
ＣＣＣＣ
ＧＧＧＧ
ＣＣＣＣ
DNAリガーゼによる結合
dCTP
宿主ｰベクター系
ベクター・・・目的遺伝子の運び手
・宿主細胞内で安定に複製する
・適当な制限酵素切断点を有する
・薬剤耐性などのマーカーを有する
シャトルベクター・・・細菌と真核生物双方で増殖できる
大腸菌
プラスミド（pUC系）
λファージ
コスミド
酵母
シャトルベクター（pUC−酵母ars1）
酵母人工染色体（YAC）
動物細胞
シャトルベクター（pUC−SV40）
レトロウイルス（MMLV由来）
昆虫細胞
バキュロウイルス
ブルーセレクション
X-gal
Br
OH
OH
Br
HO
Cl
Cl
O
HO
O
OH
N
H
NH
非酵素的
二量体化
β－ガラクトシダーゼ
O
H
N
Cl
N
H
Cl
Br
Br
O
青色色素
遺伝子クローニング
クローニング・・・ある生物から特定のDNAを取り出して増幅すること
制限酵素による切断 → ベクターDNAに結合 →
宿主細胞内で増幅 → 目的DNAを有する組換え体を選別
クローン・・・目的の遺伝子を含む組換え体
DNA供与体・・・クローニングのためDNAを取り出される生物
ファージベクターを利用したクローニング
ファージDNAに目的DNAを挿入 → パッケージング
パッケージング・・・組換えDNAをファージ粒子に挿入すること
遺伝子ライブラリー（ジーンバンク）
制限酵素などで断片化された全ゲノムDNAを含むクローン
クローニングできる遺伝子のサイズ
プラスミド（pUC系）
λファージベクター
コスミド
酵母人工染色体
～10 kb
～20 kb
～40 kb
～400 kb
塩基配列決定法
ジデオキシ法（サンガー法）
特定塩基のジデオキシリボヌクレオチドを取り込むとDNA合成が終結
↓
電気泳動でオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）を測定
↓
特定塩基までの塩基数から特定塩基の位置を決定
ATGCATGCATGCという配列のオリゴヌクレオチド
ddCTPを加えてDNA合成反応を行う
↓
ATGCATGCATGC 塩基数12
ATGCATGC
塩基数8
ATGC
塩基数4
↓
Cは4，8，12番目にある
ハイブリッド形成による遺伝子解析
ハイブリダイゼーション（交雑）
相補的な配列をもつ異種DNA同士で二本鎖を形成させること
目的配列を有するDNAを蛍光あるいは放射標識しておけば，
目的の遺伝子を含む
・プラスミドを保有するコロニー（コロニーハイブリダイゼーション）
・ファージにより形成されたプラーク（プラークハイブリダイゼーション）
・アガロースゲル上の切断DNA（サザンハイブリダイゼーション）
・アガロースゲル上のmRNA（ノーザンハイブリダイゼーション）
を検出することができる
ウエスタンブロット
ポリアクリルアミドゲル上のタンパク質 ← 標識抗体
コロニーハイブリダイゼーション
ライブラリー遺伝子を含む菌
のコロニー
プラークハイブリダイゼーション
ライブラリー遺伝子を含む
ファージのプラーク
ニトロセルロース膜にレプリカ
NaOHで変性（一本鎖DNA）
減圧加熱（DNA固定）
目的配列を持つ32P標識DNAと反応
標識されたコロニー（プラーク）から遺伝子を回収
遺伝子変異（改変）と機能解析
人為的に目的の遺伝子を変異させ，その遺伝子機能を解析する
部位指定変異導入
遺伝子内部の目的とする位置に正確に変異を導入し，改変遺伝子を作製する
変異部分を含む遺伝子配列を作製 → 相同組換え
トランスジェニック（遺伝子導入）生物
人為的に遺伝子を導入，置換，欠失させて作製した生物
（遺伝子）ノックアウト・・・正常遺伝子を欠失または不活性化させること
RNAi（RNA干渉）・・・特定にmRNAの働きを抑制 → 遺伝子機能解析
mRNAの相補鎖（アンチセンス）の導入
特定のmRNAを分解するリボザイム（酵素活性をもつRNA）の導入
siRNA・・・21～23塩基対の2本鎖RNA → 配列特異的にmRNAを切断
DNAマイクロアレイ
DNAマイクロアレイ（DNAチップ）
mRNAから作製したcDNAを蛍光ラベル
↓
基板に固定した1本鎖DNAとハイブリダイゼーション
↓
数千～数十万の遺伝子発現レベルを解析
遺伝子情報と利用
病原微生物の検出と同定
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）
鋳型DNAに対して，特定配列の1本鎖DNAと部分的2本鎖を形成させ，
相補的DNAを合成させる。相補的DNAは鋳型になりうるので，
この反応を繰り返すことにより，目的遺伝子を増幅することができる。
鋳型DNA
プライマー・・・合成した短鎖DNA
耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA合成速度が速い）
病原細菌や毒素に特異的なDNAをPCR法により検出することができる
PCR (Polymerase Chain Reaction)
サイクル１
DNA鎖の分離
プライマーの結合
DNA複製
サイクル２
cDNAの調製（RT-PCR）
mRNA
ＡＡＡＡＡＡ
プライマーの結合
ＡＡＡＡＡＡ
ＴＴＴＴＴＴ
DNAへの逆転写
ＡＡＡＡＡＡ
ＴＴＴＴＴＴ
アルカリ処理（mRNAを分解）
ＴＴＴＴＴＴ
混成２本鎖
１本鎖 cDNAの3'末端は
ヘアピンループを形成
DNA複製
ＡＡＡＡＡＡ
ＴＴＴＴＴＴ
S1ヌクレアーゼ処理
ＡＡＡＡＡＡ
ＴＴＴＴＴＴ
(PCR)
２本鎖 cDNA
遺伝子解析法
リアルタイムPCR
蛍光色素が結合した短鎖DNAをプローブ（探査針）として用いたPCR
プローブまで相補鎖合成が進むと蛍光を発する → 定量可能
RAPD（Randomly Amplified Polymorphic PCR）
ランダムに合成した10塩基程度のプライマーを用いたPCR
種の比較などに利用する
AP-PCR（Arbitrarily Primed PCR）
反応初期の数サイクルの2本鎖形成条件を緩くし，
1つのプライマーを用いて染色体中の複数の領域を同時に増幅させるPCR
バンドのパターンから遺伝的多型性などを評価できる
パルスフィールドゲル電気泳動法
数百kb～数Mbの高分子DNAを分離できる
バイオテクノロジーの発展
ポリペプチドは遺伝子工学により作ることができる → バイオ医薬品
バイオ医薬品
遺伝子組換え技術あるいは細胞培養技術を用いて製造された
ポリペプチドまたはタンパク質を有効成分とする医薬品
微生物分野におけるバイオ医薬品
遺伝子組換えワクチン・・・B型肝炎，ヒトパピローマウイルス
抗体・・・抗RSウイルス抗体
遺伝子組換え作物
害虫抵抗性遺伝子・・・BTトキシン
除草剤耐性遺伝子
代表的なバイオ医薬
医薬
ペプチドホルモン
インスリン
成長ホルモン
心房性ナトリウム利尿ペプチド
グルカゴン
サイトカイン
インターフェロンα
インターフェロンγ
インターロイキン２
増殖因子
エポエチン（エリスロポエチン）
G-CSF
適用
製造法
糖尿病
小人症
急性心不全
低血糖症
大腸菌
大腸菌
大腸菌
酵母
C型肝炎，がん
がん
がん
大腸菌
大腸菌
大腸菌
貧血
白血球減少
動物細胞
大腸菌
代表的なバイオ医薬
医薬
酵素
t-PA
エプタコグアルファ（血液凝固第VII因子）
オクトコグアルファ（血液凝固第VIII因子）
受容体
エタネルセプト（TNF-α受容体）
ワクチン
Ｂ型肝炎ワクチン
抗体
トラスツズマブ（ハーセプチン：抗HER2抗体）
リツキシマブ（リツキサン：抗CD20抗体）
バシリキシマブ（抗CD25抗体）
インフリキシマブ（抗TNF-α抗体）
パリビズマブ（抗RSウイルス抗体）
適用
製造法
血栓溶解
血友病
血友病
動物細胞
動物細胞
動物細胞
関節リウマチ
動物細胞
Ｂ型肝炎
酵母
乳がん
悪性リンパ腫
腎移植
関節リウマチ
RSV気道感染症
動物細胞
動物細胞
動物細胞
動物細胞
動物細胞
遺伝子組換えと生物多様性
組換え生物
病原遺伝子，毒素遺伝子などの危険な遺伝子が拡散する可能性
在来生物が駆逐され，生物多様性が損なわれる可能性
物理的封じ込め
実験施設の設備，装置による封じ込め P1～P3
生物学的封じ込め
実験に用いる生物の環境における生存能力に関する規制
B1 Escherichia coli K12など
B2 Escherichia coli χ1776など（遺伝的欠陥により特殊培養条件必要）
カルタヘナ議定書
生物多様性に影響する可能性のある組換え生物の取り扱い法を制限

Download Report