内部標準について ○ 内部標準とはラダーを含めた全サンプルに Lower Marker と Upper Marker が出現します。この二つを内部標準と呼びます。左図は高感度 DNA アッセイの例で、キットによっては UM がない場合があります。 ○ 各キットにおける内部標準の種類と補足情報解析タイプサンプルの染色方法 LM DNA 1K 7000 bp dｓDNA DNA 12K 蛍光物質 LabChip 内で染色直前と直後のラダー 7000 bp dｓDNA RNA 50 nt RNA RNA高感度タンパク質 LabChip 内で染色タンパク質高感度蛍光物質を事前に付加タンパク質低分子 LabChip 内で染色等電点変異体解析直前のラダー 2000 bp dｓDNA なし DNA 5K 糖鎖解析サンプル解析に使用するラダーデータ 1500 bp dｓDNA DNA高感度ゲノム DNA UM 蛍光物質を事前に付加なし蛍光物質付きの 1.4kDaペプチドなし蛍光物質付きのマルトース六量体なし直前のラダー直前と直後のラダーなし ○ 内部標準の役割その１: 移動度の補正本装置では、各サンプルを一つずつ解析します。各泳動では移動度が少しずつ異なります。補正前では、右側のサンプルほどゆっくり流れています（ピークが全体に上の方に出現しています）。泳動が完了した後で、全サンプルを LM と UM で整列させ、その移動度に合わせてサンプルのピークを移動させることにより、正しいサイズが得られるようになります。この処理は自動で行われます。 ○ 内部標準の役割その2: 濃度の補正サンプルピークの濃度は、ラダーのピークの強度と比較して算出します。図の例ではラダーのピークが100、サンプルのピークが220（それぞれ▼で表示）なので、 (220÷100)×２ng/mL = 4.4 ng/mL とまず計算します。ラダーには不純物が含まれないため、Dye が最大効率で蛍光を発します。これに対し、サンプルには塩や不純物が含まれていることがあり（例：PCR産物）、Dye が発する蛍光強度を弱めてしまいます。この効果を補正するために内部標準を使用します。 UM は二本鎖 DNA なので、サンプルのピークと同じ挙動を示します。図の例では、ラダーのUMが400なのに対し、サンプルでは200と半分になっています。ですので、もしサンプルの純度が高ければその UM は2倍の400を示し、サンプルピークも2倍になるはずです。これを勘案して求まる最終濃度は次のようになります。 (220÷100)×２ng/mL ×(400÷200) = 8.8 ng/mL