熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System Title 成人B細胞性急性リンパ性白血病におけるIKZF１遺伝子異常 Author(s) 徳永, 賢治 Citation Issue date 2014-03-25 Type Thesis or Dissertation URL http://hdl.handle.net/2298/30040 Right 学位論文 Doctoral Thesis 成人B細胞性急性リンパ性白血病におけるIKZF1遺伝子異常 (IKZF1 genetic alterations in adult patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia) 徳永賢治 Kenji Tokunaga 熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻血液内科学指導教員満屋裕明教授熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻血液内科学２０１４年３月 1 目次 1. 要旨 2. 発表論文リスト 3. 謝辞 4. 略語一覧 5. 研究の背景と目的 6. 実験方法 7. 実験結果 8. 表および図 9. 考察 10. 結語 11. 参考文献 2 1. 要旨【目的】 B 細胞分化に関わる IKAROS family zinc finger 1 (IKZF1)遺伝子の変異は小児の B 細胞性急性リンパ性白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia; B-ALL)において予後不良因子として新たに報告された。しかし成人 B-ALL においてその遺伝子異常の頻度や予後への影響についての報告は乏しい。私は成人 B-ALL 78 症例において IKZF1 遺伝子異常の頻度および予後との関係を解析し、変異の意義を検討した。【方法】成人 B-ALL 78 症例において、total RNA を用いて RT-PCR により IKZF1 を増幅し、異常アイソフォームおよび変異の検出を行った。ゲノム DNA を用いて RQ−PCR や PCR により IKZF1 の部分欠失を検索した。IKZF1 遺伝子異常と臨床所見との関係を解析した。【結果】 20 例に IKZF1 の異常アイソフォームを認め、40 例に部分欠失を認めた。点突然変異は認められなかった。78 症例中 IKZF1 遺伝子異常は 41 例(52.6%)に認められ、成人では小児よりも高頻度であった。異常アイソフォームは Ik6 および Ik10 で、多くはゲノム DNA のエクソン欠失に由来していた。一方で、エクソン欠失が認められないもののスプライシング異常によるアイソフォームが検出される例や、一部の白血病クローンにのみ遺伝子異常が存在する例など複雑な異常を呈するものが 7 例あり、IKZF1 遺伝子異常は多様であった。IKZF1 遺伝子の異常は、フィラデルフィア染色体陰性例では 54 例中 21 例(38.9%)に対して、フィラデルフィア染色体陽性例では 24 例中 20 例(83.3%)と、フィラデルフィア染色体陽性 B-ALL に高頻度に認められた(Ｐ＝0.0004)。全例の全生存率および無再発生存率に IKZF1 遺伝子異常の有無による統計学的有意差を認めなかった。【考察】成人 B-ALL において IKZF1 遺伝子の異常が多く認められた。IKZF1 遺伝子変異例は小児 B-ALL においても予後不良とされ、小児 B-ALL に比して成人 B-ALL が予後不良である理由の一つである可能性がある。また成人例では小児例ほど IKZF1 遺伝子異常が予後に大きく寄与しないことや、遺伝子異常の多様性から、成人 ALL では小児例にはない変異が潜在していることが示唆された。さらに、複数の IKZF1 異常の検出法を組み合わせて解析した本研究では既報と比較して IKZF1 遺伝子異常を高頻度に検出した。今後臨床研究を進めるうえで多様な IKZF1 遺伝子異常を複数の検出法で評価する必要性があると考えられた。【結論】成人 B-ALL では IKZF1 遺伝子異常が高頻度かつ多様に認められた。これは成人 B-ALL における病因・病態の複雑性を示唆し、小児例とは異なる遺伝子異常の検索が今後も必要であると考えられる。 3 2. 発表論文リスト 1) 関連論文 (1) Kenji Tokunaga, Shunichro Yamaguti, Eisaku Iwanaga, Tomoko Nanri, Taizo Shimomura, Hitoshi Suzushima, Hiroaki Mitsuya and Norio Asou. High frequency of IKZF1 genetic alterations in adult patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Eur J Haematol. 2013;91:201-208. 2) その他の論文 (1) 徳永賢治,山口俊一朗,麻生範雄「後天性無トランスフェリン血症」, 別冊日本臨牀血液症候群（第２版）Ⅰ,日本臨牀社 (大阪), 143-145, 2013. (2) 徳永賢治,山口俊一朗,麻生範雄「非白血性白血病」, 別冊日本臨牀血液症候群（第２版）Ⅲ,日本臨牀社 (大阪), 209-213, 2013. (3) 徳永賢治,麻生範雄「CBL 変異と骨髄系腫瘍」, 血液フロンティア, 医薬ジャーナル社 (大阪), 23: 512-517, 2013. 4 3. 謝辞本研究の機会を賜り御指導頂きました熊本大学大学院医学教育部血液内科学分野教授満屋裕明先生に深く感謝いたします。直接御指導いただきました熊本大学大学院医学教育部血液内科学分野准教授(現埼玉医科大学国際医療センター造血器腫瘍科教授) 麻生範雄先生、同准教授奥野豊先生に深く感謝いたします。更に共同研究者の熊本大学大学院医学教育部血液内科分野大学院生山口俊一朗君、および研究に御助力頂いた熊本大学医学部附属病院血液内科助教(現熊本第一病院血液内科) 南里知子先生、くまもと森都総合病院血液内科鈴島仁先生、同下村泰三先生に深謝いたします。 5 4. 略語一覧 ALL : acute lymphoblastic leukemia ABL1 : c–abl oncogene 1 B-ALL : B-cell acute lymphoblastic leukemia BCR : breakpoint cluster region CDKN2A/2B : cyclin–dependent kinase inhibitor 2A and 2B CR : complete remission CRLF2 : cytokine recptor–like factor 2 FAB : French–American–British HDAC : histone deacetylase IKZF1 : IKAROS family zinc finger 1 Ik : IKZF1 isoform JAK2 : janus kinase 2 JALSG : Japan Adult Leukemia Study Group MDS : myelodysplastic syndrome MLL : mixed lineage leukemia MLPA : multiplex ligation–dependent probe amplification MYC : v–myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog NCBI : national center for biotechnology information OS : overall survival PAX5 : paired box 5 PCR : polymerase chain reaction Ph : Philadelphia chromosome + : Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia – Ph ALL : Philadelphia chromosome negative acute lymphoblastic leukemia RAG1 : recombination activating gene 1 RFS : relapse free survival RNaseP : ribonuclease P RQ-PCR : real–time quantitative polymerase chain reaction RT-PCR : reverse transcription polymerase chain reaction TKI : tyrosine kinase inhibitor Ph ALL 6 5. 研究の背景近年、細胞遺伝学的解析に基づく治療戦略の改善により、小児の B 細胞性急性リンパ性白血病 (B-cell acute lymphoblastic leukemia: B-ALL) では、高い寛解率と治癒率がえられるようになった 1。しかし、成人 B-ALL においては依然このような進歩に乏しい。成人では、予後不良であるフィラデルフィア染色体陽性 ALL (Ph+ALL)がおよそ 1/3 を占め 2、一方で予後良好とされる t(12;21)(p13;q12)転座や超高二倍体などの頻度が少ない 1,3 。成人と小児 ALL での予後の差は、このような細胞遺伝学的な差異によるものとされている。小児 B-ALL では予後不良例における治療戦略が課題の一つとなり、更に遺伝子異常の解析が進んでいる。その結果 IKAROS family zinc finger 1 (IKZF1)遺伝子の異常が小児 B-ALL において新たな予後不良因子として報告された 4。さらに、リンパ球系の分化や細胞周期制御に関わる paired box 5 (PAX5)、janus kinase 2 (JAK2)、cytokine recptor–like factor 2 (CRLF2)、cyclin–dependent kinase inhibitor 2A/2B (CDKN2A/2B)などの遺伝子異常が小児 B-ALL 症例においてみられることが、ゲノムレベルの広範囲にわたる解析の結果明らかにされている 5。PAX5 変異は小児 B-ALL の 31.7%に認められ 4、PAX5 の機能喪失により前駆 B 細胞から成熟 B 細胞分化が障害され白血病へ至るとされる。CRLF2 および JAK2 は、B 細胞の増殖を促す thymic stromal lymphopoietin 7 シグナル経路に関係し、これら変異は小児 B-ALL のハイリスク例においてそれぞれ 14、7.7%に認められ、変異例は予後が悪い 6。IKZF1 遺伝子は、リンパ球分化初期に働く IKAROS タンパクをコードし、ノックアウトマウスでは B 細胞の分化が阻害される 7。IKAROS のホモダイマーは DNA に結合し、クロマチンのリモデリングに関わるヒストン脱アセチラーゼ (histone deacetylase: HDAC) 複合体を形成する。 IKAROS はリンパ球系腫瘍において腫瘍抑制遺伝子として作用することが知られており、IKZF1 遺伝子の異常はリンパ球の正常な分化や増殖を障害すると考えられ、小児 B-ALL において低い無再発生存率 (relapse-free survival: RFS) や全生存率 (overall survival: OS) に関与するとされる 8。これら遺伝子の異常は治療の層別化に役立つと期待されているが、成人 B-ALL においてはその頻度や臨床的意義が不明確である。今回私たちは成人 B-ALL 78 症例において IKZF1 遺伝子異常の頻度および予後との関係を解析し、変異の意義を検討した。 8 6. 実験方法 1) 臨床検体熊本大学医学部附属病院血液内科において 1986 年から 2010 年にかけて B-ALL と診断された 78 例の成人症例において IKZF1 遺伝子異常を調べた。診断は以前の報告のとおり French-American-British (FAB) 分類および WHO 分類に基づいた細胞形態学的解析、染色体解析および細胞表面マーカー解析によって行った 9,10。症例は 15 歳から 86 歳まで分布し、中央値は 54 歳であった。全例 Japan Adult Leukemia Study Group (JALSG) のプロトコールに従って治療を受けている 11-15。診断時における末梢血または骨髄液から単核球を分離した。ジェノミック DNA は単核球からフェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿で得た。RNA をトリゾール(Trizol, Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて抽出し、オリゴ dT プライマーを使用して Superscript Ⅲ Cells Direct cDNA Synthesis Kit (Life Tchnologies)を用い製品プロトコールに従って cDNA を合成した。ジェノミック DNA および cDNA を用いて以下の遺伝子解析を行っている。この研究で臨床検体を用いるにあたり、改訂ヘルシンキ宣言に従って説明および同意を確認した。また、熊本大学倫理審査委員会の承認を得て、本遺伝子解析研究を行った。 9 2) reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (1) Ph+ALL のスクリーニング以前の報告の通りメジャーおよびマイナーBCR-ABL1 融合遺伝子検出することで Ph+ALL のスクリーニングを行った 16。 (2) IKZF1 アイソフォームのスクリーニング RT-PCR により IKZF1 の cDNA エクソン 1 からエクソン 8 にかけて増幅した。 polymerase chain reaction (PCR)はサーマルサイクラー (Whatman Biometra, Goettingen, Germany)と、Taq ポリメラーゼ (Life Technologies)、および以下のプライマーペアを用いて行った：IKZF1 エクソン 1 プライマー 5’-AAAGCGCGACGCACAAATCC-3’、 IKZF1 エクソン 8 プライマー 5’-ATGGCGTTGTTGATGGCTTGGTC-3’。PCR 産物をアガロースゲル電気泳動しアイソフォームの発現をみた。バンドとして分画されたアイソフォームをゲルより切り出し、Gel/PCR DNA Isolation System (VIOGENE, New Taipei City, Taiwan)を用いて抽出したのち、TA クローニングを行った。 (3) シークエンス IKZF1 の点突然変異の殆どはジンクフィンガー領域で報告されており、同領域を以下のプライマーペアを用いて RT-PCR で増幅後ダイレクトシークエンスを行った：フォワードプライマー 5’-GAGAATGGGCGTGCCTGTGAAA-3’、リバースプラ 10 イマー 5’-CCGGAAGGCCCATGCTTTCCAA-3’。シークエンスは BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) を用いて、Sequencing Analysis version 3.4 software (Applied Biosystems) で解析を行った。PAX5 および JAK2 についても cDNA を用いてシークエンスを行った。PAX5 は蛋白をコードする全域を増幅し、 JAK2 については変異が集中してみられるエクソン 14 および 18 が含まれるように PCR で増幅して、シークエンスを行っている 6。 3) 定量的リアルタイム PCR (real–time quantitative PCR, RQ-PCR) IKZF1 遺伝子エクソン 2 とエクソン 7 のジェノミック DNA コピー数を以前の報告の通りに解析した 19。RNaseP (Applied Biosystems) を内部コントロールとし、ECO Real time PCR system (Illumina, San Diego, CA) を使用し、ΔΔCT 法で評価を行った。1 検体あたり 3 つ PCR を行い結果を平均し、0.3 未満を 2 アリルの完全欠失、0.3 から 0.8 を 1 アリルの半欠失、0.8 以上を欠失なしと判定した。健常者 2 例とモノソミー 7(IKZF1 は 7 番染色体に座しているため)を有する急性骨髄性白血病 (Acute Myeloid Leukemia, AML) 症例 1 例をコントロールとした。 4) ジェノミック PCR 11 IKZF1 におけるイントロン 1 と 7、およびイントロン 3 と 7 の融合を検出するため、ジェノミック DNA を以下のプライマーを用いて PCR を行った：イントロン 1 プライマー 5’-GGCATGGGGCAGTGTGGAAGAG -3’、イントロン 3 プライマー 5’-AGGGAAAGGAGCAGTGCTTACACA-3’、イントロン 7 プライマー 5’-AAGGCTGCACTTTGCCTCACCA-3’。プライマーは、一般的な断点である recombination activating gene 1 (RAG1) 結合部位をカバーするように設計した 19,20。 PCR では Ex Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) を使用した。PCR 産物をアガロースゲル電気泳動し、バンドが検出されたものはダイレクトシークエンスを行った。 5) TA クローニング IKZF1 アイソフォームは TA クローニングによりシークエンスを調べた。TOPO TA Coning Kit (Life Technologies)および DH5α コンピテントセルを用いて、製品プロトコールに従いクローニングを行った。プラスミドは Mini Plus plasmid extraction kit (VIOGENE)により抽出し、挿入部位を M13 フォワード (–20) プライマーおよび M13 リバースプライマーでシークエンスした。 6) 統計処理 12 治療効果は従来の一般的な基準に基づき判定した 21。OS は診断日より死亡あるいは最終観察日までの期間、RFS は寛解日より再発、死亡、あるいは最終観察日までの期間である。臨床的および生物学的特徴を遺伝子異常の有無により比較した。カテゴリー変数はχ2 検定あるいはフィッシャー直接検定で、連続変数はウィルコクスン順位和検定で比較した。OS および RFS はカプラン・マイヤー法で推計し、ログランクテストで比較した。統計解析には JMP software version 7 (SAS Institute Inc., Cary, NC) を使用した。 13 7. 実験結果 1) 成人 B-ALL における IKZF1 アイソフォーム：Ik6 と Ik10 72 例の成人 B-ALL において RT-PCR により計 20 例の IKZF1 ドミナントネガティブアイソフォームを認めた。Ik6 が 13 例で、Ik10 が 7 例であった (Figure 1A-B)。他のドミナントネガティブアイソフォームである Ik8 や Ik9 は検出されなかった。Ik6 を呈した 1 例については DNA 検体を得られなかったが、残りの 19 例については DNA での解析が可能であった。19 例のうち、Ik6 が陽性であった 12 例では 11 例にイントロン 3 と 7 の融合を、Ik10 が陽性であった 7 例では全例にイントロン 1 と 7 の融合を認めた (Figure 1C)。 DNA 融合バンドを認めなかった Ik6 陽性の 1 例(#28)は、RT-PCR で複数のアイソフォームを呈していた (Figure 2A, B, C)。これらアイソフォームをサブクローニングしたところ、それぞれ Ik6 と、イントロン 3 にある 60 塩基のシークエンスが挿入されたもの(Figure 2D)、エクソン 1、4 と 8 から成る特異なアイソフォームであった。最後のアイソフォームは過去に報告がない。挿入された 60 塩基はスプライスドナー/ アクセプターサイトに接していた。 IKZF1 のジンクフィンガー領域において点突然変異は 1 例も認めなかった。 14 2) 成人 B-ALL における IKZF1DNA コピー数の異常 IKZF1 の DNA コピー数とアイソフォームの発現との関係について、共に解析が可能であった 64 例について調べた。RT-PCR により検出されたドミナントネガティブアイソフォームの発現、RQ-PCR で得られた IKZF1 のエクソン欠失 (DNA コピー数) の結果、およびジェノミック PCR により検出されたイントロン−イントロン融合の有無を Table 1 にまとめて示す。64 例中 39 例に異常アリルを認めた。Ik6 陽性の 10 例、Ik10 の 5 例ではそれぞれエクソン 4−7 の欠失 (Δ4–7)、エクソン 2−7 の欠失 (Δ2– 7) を認めた。Ik6 陽性となった 2 例と Ik10 の 5 例では、それぞれ Δ4–7 と Δ2–7 が 2 つのアリル共に認められた。19 例では大きな欠失が認められた。6 例では遺伝子全域にわたる欠失を、4 例では 5’側の、9 例では 3’側の欠失をそれぞれ認めた。1 例では 3’側欠失を 2 アリル共に認めた。成人 B-ALL での IKZF1 アリルの異常は様々であった。症例#28 を含む 7 例では複雑な結果が得られた (Table 1B)。2 例では Δ4–7 を認めるものの、Ik6 の発現を認めなかった (Figure 1B, #37 と#65)。3 例では、イントロン 3–7 或いは 1–7 の融合を認めるものの、エクソン 2 および 7 の DNA コピー数は正常であった。症例#82 では 3 つのアリルの存在が示唆された。ジェノミック PCR ではイントロン 3–7 融合のバンドとイントロン 3–7 の淡いバンドを認め (Figure 1C)、異 15 常アリルに寡多があることがうかがわれた。 6 例では DNA を使った解析のみ可能であった。1 例でエクソン 2 と 7 のコピー数の低下があったが、融合バンドは検出できなかった。RT-PCR のみでの解析となった 8 例中 1 例で Ik6 の発現を認めた。 3) Ph+ALL における IKZF1 の異常ドミナントネガティブアイソフォーム (Ik6 と Ik10)、DNA コピー数の異常、エクソン欠失によるイントロン間の融合など IKZF1 の異常は 78 例の成人 B-ALL 症例のうち 41 例 (52.6%) (Table 2)で認められた。IKZF1 異常例ではヘモグロビン値が低い傾向にあった (P = 0.0586)。年齢、性別、白血球数、血小板数は IKZF1 異常の有無により差はなかった。IKZF1 異常は、Ph 陰性 ALL (Ph–ALL)では 54 例中 21 例 (38.9%) であるのに対し、Ph+ALL では 24 例中 20 例 (83.3%)と、Ph+ALL で有意に高頻度であった (P = 0.0004)。Ph–ALL で、その他染色体と IKZF1 異常とではっきりと相関がみられるものはなかったが、mixed lineage leukemia (MLL)遺伝子転座や v–myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog (MYC)遺伝子転座を伴う例では IKZF1 異常を認めなかった (Table 2)。 16 4) 成人 B-ALL における IKZF1 異常と予後 IKZF1 異常の有無で OS や RFS を比較したところ、統計学的有意差は認めなかった (Figure 3A)。さらに、Ph–ALL 群 (Figure 3B) および Ph+ALL 群 (Figure 3C)、それぞれで IKZF1 異常の有無で比較したが、有意差を認めていない。年齢 (60 歳以上)、白血球数 (30 × 109/L 以上)、核型 (Ph、MLL 転座、複雑核型など)に基づきハイリスクグループを抽出し、OS および RFS を検討したが同様であった。 5) PAX5 および JAK2 変異 PAX5 変異は 60 例中 4 例 (6.7%) に認められた。4 つの変異全て DNA 結合部位であるペアードドメインに認められた。PAX5 変異の有無により臨床所見や予後が変わることはなかった。JAK2 は 66 例で解析を行ったが変異を認めなかった。 17 表および図 8. Table 1 (A) Allele types found in 64 patients with adult B-ALL. RQ-PCR (Copy No.) Allele type Fusion RT-PCR No. of Pt. Exon2 Exon7 Int. 3-7 Int. 1-7 wt wt 2 2 - - 25 wt + Δ4-7 wt / Ik6 2 1 + - 7 wt+ Δ2-7 wt / Ik10 1 1 - + 3 wt + 5’ deletion wt 1 2 - - 4 wt + 3’ deletion wt 2 1 - - 8 wt + whole deletion wt 1 1 - - 4 bi-allelic Δ4-7 Ik6 2 0 + - 1 Δ4-7 + whole deletion Ik6 1 0 + - 2 bi-allelic Δ2-7 * Ik10 0 0 - + 2 bi-allelic 3’ deletion - 2 0 - - 1 other 7 Total 64 wt : wild-type * : The assessment of mono-allelicΔ2-7 with whole deletion is also possible. (B) Complex allele types found in 7 patients with adult B-ALL. RQ-PCR (Copy No.) Pt. No. (#) Allele type Fusion RT-PCR No. of Pt. Exon2 Exon7 Int. 3-7 Int. 1-7 #28 wt + Δ4-7 wt / Ik6 2 2 - - 1 #37,65 wt + Δ4-7 wt 2 1 + - 2 #51 wt + Δ4-7 wt 2 2 + - 1 #59 wt + Δ4-7 wt / Ik6 2 2 + - 1 wt / Ik10 2 2 + + 1 wt / Ik10 2 2 - + 1 #82 wt + Δ4-7 wt + Δ2-7 #105 wt + Δ2-7 Total 7 wt : wild-type 18 Table 2: Clinical profiles in B-ALL patients with and without IKZF1 alterations. Total No.of patients IKZF1 alternation (+) P value 41 37 (15 -86) 54(16 - 74) 0.6555 34/44 15/26 19/18 0.1891 16.8(1.7-709.8) 20.2(2.2-579) 14.4(1.7-709.8) 0.5924 Hb ( g/dL ) 9.95(4.5-16.8) 10.4(4.7-16.8) 8.8(4.5-15) 0.0586 Plt (×109/L) 61(7-748) 68(7-748) 52(9-531) 0.2953 CR （%） 74 75.6 72.2 0.7352 Normal 15 8 7 11q23 2 0 2 t(8;14) 3 0 3 unknown 22 7 15 Other 12 6 6 24 20 4 Age (years) M/F WBC (×109/L) 78 IKZF1 alternation (-) 53 (15-86)* 52 Karyotype NonPh Ph * : median ( range) 19 0.0004 Figure 1: IK ZF1 isoforms Figure1. IKZF1 におけるドミナントネガティブアイソフォーム (A) exon 1 2 3 Ik1 Ik2 4 6 5 7 8 (A) IKZF1 には異なる 13 種類のアイソフォームが知られている (NCBI Reference … Gene database)。全てのアイソフォームは Ik6 Ik7 二量体を形成するために C 末端に二つの Ik8 Ik10 ジンクフィンガー(灰色四角)を有している。アイソフォームは N 末端側のエクソンの構成が異なる。4 つの N 末端側のジン (B) クフィンガーは DNA 結合に作用し、3 つ M 1 2 3 4 以上あれば標的遺伝子のプロモーター領 Ik1 Ik2 Ik3 Ik2a Ik4a Ik6 Ik10 域の DNA への親和的結合能をもつが、Ik6 や Ik10 のように 2 つ以下のものは DNA 結合能を持たず、ドミナントネガティブに作用する。 (B) IKZF1 の RT-PCR 産物の電気泳動。大きな分画にある機能的 IKZF1 アイソフォ (C) a) ーム(レーン 1 と 4)と共に小さな分画にド 7 8 16 30 82 106 H1 H2 ミナントネガティブアイソフォームが検出される(レーン 2 と 3)。レーン M はサイズマーカー。右の白線はアイソフォーム分画を示す。 b) (C) エクソン欠失により生じる異なるイントロン間の融合のジェノミック DNA PCR による検出。各レーンの番号は症例番号で、H1 と H2 は健常者検体である。矢印で示されるように、a)では約 1200 塩基サイズにイントロン 3-7 融合による PCR 産物が、b)では約 1650 塩基サイズにイントロン 1-7 融合による PCR 産物が確認出来る。症例#16 では欠失を認めない。症例#82 では淡いバンドではあるが、イントロン 3-7 とイントロン 1-7 が共に検出された。 20 Figure 2: Multiple dominant negative Figure 2. 症例#28 におけるジェノミ isoforms without genomic DNA ック DNA 欠失を伴わない複数のドミ deletions of IKZF1 ナントネガティブアイソフォームの発現。 (A) #2 M る 3 つの異なるアイソフォームのバンド NA 8 LM 6 (A) RT-PCR では矢頭 A、B、C で示されが検出された。NALM6 は B-ALL の細胞株で IKZF1 の野生型コントロールとして使用した。M はサイズマーカーである。 A B C (B) 症例#28 ではイントロン間の融合バンドを認めていない。P1 および P2 はそれぞれイントロン 1-7 および 3-7 融合の陽 (C) TA クローニングで明らかになったアイソフォーム A、B、C の構成。バンド A、 #2 P2 P1 #2 M P2 Intron 1 - 7 8 Intron 3 - 7 P1 (B) 8 性コントロールである。 B および C がそれぞれ Ik-A、-B および-C に相当する。Ik-A は Ik10 にエクソン 4 が付加されており、Ik-B は Ik6 にイントロン 3 に由来する 60 塩基の配列が挿入されている。Ik-C は Ik6 であった。 (D) Ik-B に挿入されている 60 塩基とその (C) exon 1 2 3 Int. 4 5 6 7 8 Ik1 Ik -A 前後の配列。60 塩基は AG と GT のスプライス部位に接している。 Ik -B Ik -C (Ik6) Ik10 (D) TGCAGTTACATATGGGGCTGATGACTTTAG GGATTTCCATGCAATAATTCCCAAATCTTT CTCTCGTAAG 21 Figure 3: Overall survival (OS) in Figure 3. B-ALL (A)、Ph–ALL (B)、 B-ALL patients by IKZF1 alteration. Ph+ALL (C) 症例それぞれにおける OS を IKZF1 異常の有無により解析し probability!! (A) OS in all patients た。 !!!!!!!!IKZF1!altera'on!(+) !N=!41 !!!!!!!!IKZF1!altera'on!(1) !N=!37 Log!rank!test!!P=!0.9494!! years!! probability!! (B) OS in patients with Ph–ALL !!!!!!!!IKZF1!altera'on!(+) !N=!21 !!!!!!!!IKZF1!altera'on!(1) !N=!33! Log!rank!test!!P=!0.8018!! years!! probability!! (C) OS in patients with Ph+ALL !!!!!!!!IKZF1!altera'on!(+) !N=!20! !!!!!!!!IKZF1!altera'on!(1) !N=!24! Log!rank!test!!P=!0.9711!! years!! 22 9. 考察本研究において、成人 B-ALL における IKZF1 の異常は小児例よりも高頻度であった。78 例の成人 B-ALL において IKZF1 異常を 41 例 (52.6%) に認めた。Mullighan らは、小児 B-ALL のあらゆるリスクグループを通じて、8.9%に IKZF１の異常を認めたと報告している 5。 Ph+ALL では 24 例中 20 例 (83.3%) に IKZF1 の異常を認めたが、これは小児例における既報と齟齬しない 18, 19。Mullighan らは小児 Ph+ALL で IKZF1 の異常が 83.7%であったと報告している 18。Ph–ALL において、我々の研究では 54 例中 21 例 (38.9%) に IKZF1 の異常を認め、10%とした小児での報告 18 より高頻度であった。このように予後が悪いとされる異常が成人例でより高い頻度で潜在していることは、成人 B-ALL の予後が小児と比較して総じて不良であることの原因である可能性がある。本研究では、RT-PCR、RQ-PCR およびジェノミック PCR といった複数の手法を用いて、様々な IKZF1 の異常を明らかにした。RQ-PCR による IKZF1 エクソン 2 と 7 のコピー数の測量と RT-PCR との組み合わせにより、IKZF1 ジェノミック DNA の大きな欠失も検出可能であった。IKZF1 遺伝子の大きな欠失は、成人 B-ALL においてよく認められた (Table 1)。3 つの異なるアリルを認めた症例#82 により、成人 B-ALL では割合は少ないものの異なる数個のアリルが存在し得ることが分かった。これによ 23 り、IKZF1 異常を有する白血病細胞は全白血病細胞のなかで僅かな分画として存在することがあることが分かった。このようなマイナーなクローン中に存在する IKZF1 の異常をも洩らさず検出するためには、複数の異なる手法を組み合わせて用いる必要がある。Moorman らは、454 例の青少年期および成人の Ph–ALL において multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)法を用いて 87 例 (19.2%) に IKZF1 の欠失があったことを報告している 22。対象集団は小さいが、我々は Ph–ALL でより高頻度に IKZF1 の異常を認めた。これは複数の手法を組み合わせた結果によるものである。MLPA は小さな分画にある白血病細胞の遺伝子異常に対して感度が高くない 23。異常を伴う細胞が 50%以上を占める場合に限り MLPA は 1 アリルの欠失を検出することができる 23。マイナークローンにある異常をとらえるためには、ジェノミック PCR のほうが、感度が高い。ドミナントネガティブアイソフォームである Ik6 と Ik10 の殆どは遺伝子 DNA 内の欠失によるものであった。Ik6 の 11 例中 10 例と Ik10 の 7 例全てはそれぞれ Δ4–7 と Δ2–7 に由来していた。ジェノミック PCR による PCR 産物の長さは概ね揃っていた (Figure 1C)。これは断点が特定の領域に集中していることを示している 19, 20。断点の近傍には RAG1 結合部位がしていることから、IKZF1 の欠失には RAG1 が関係していると考えられる 18, 19, 20。RAG1 が作用すると DNA を保全するため修復機構が働く 24 が、B-ALL ではこの修復機能が低下していると報告されている 24。成人 B-ALL における IKZF1 の欠失には DNA 維持機能の障害が関係していることが示唆される。 DNA の欠失がないにも関わらず、1 例では(症例#28)では Ik6 含め複数のアイソフォームを発現していた。症例#28 の RT-PCR 産物のサブクローニングにより、これらアイソフォームは Ik6 と、イントロン 3 に由来する挿入を伴う Ik6、およびエクソン 4 が挿入された Ik10 であった (Figure 2C)。Dupuis らも Δ4–7 がないにも関わらず Ik6 mRNA および蛋白を発現していた B-ALL 症例を報告している 25。このようなドミナントネガティブアイソフォームの発現には、転写後のエクソンのスプライシングが必要である。RNA スプライシング機構の変異が、骨髄異形成症候群で高頻度に認められスプライシングのエラーや蛋白への誤翻訳がみられることが近年分かってきた。 IKZF1 の異常もスプライシングの異常で生じうるものであり、成人 B-ALL における IKZF1 ドミナントネガティブアイソフォームの生成には DNA 欠失以外にも原因があることが示唆される。小児の B-ALL と比較し、IKZF1 の異常は成人 B-ALL の予後に大きな影響をあたえていなかった。青少年期および成人の Ph–ALL において IKZF1 の異常は強い影響をもたないとの Moorman らの報告がある 22。チロシンキナーゼ阻害薬 (tyrosine kinase inhibitor: TKI) の使用は Ph+ALL の予後を改善した 27-29。Ik6 の発現は TKI に対する治 25 療抵抗性を誘導する 30、Ik6 や Ik10 を発現する Ph+ALL では TKI を用いた寛解導入療法後３ヶ月時点での再発が多い 20、IKZF1 の欠失を伴う Ph+ALL では TKI 使用した治療での無病期間が短い 31 などの少数症例を解析した報告があるが、いずれも OS に差を認めていない。唯一 Dupuis らが IKZF1 の異常は OS に影響すると報じているが、やはり少数例での解析である 25。成人と小児の B-ALL に対する化学療法は、使用される薬剤や治療強度が異なる。加えて、年齢ごとに遺伝子異常のプロファイルが異なるともいわれている 33。また、JAK2 や PAX5 についても本研究において成人と小児とで頻度が異なっていた。これらにより IKZF1 異常が成人と小児とで臨床予後への影響が異なるものと考えられる。我々の研究において IKZF1 異常は成人 B-ALL の OS や RFS に有意差を与えるものではなかったが、少数例での解析にとどまっており、臨床的意義を明らかにするためには今後大規模な臨床研究が望まれる。IKZF1 の異常を評価する際には、その多様性をふまえて複数の手法によるアセスメントが必要であろう。 26 10. 結語 RT-PCR、RQ-PCR およびジェノミック PCR を組み合わせて用いて、成人 B-ALL において IKZF1 の異常が高頻度に認められることを示した。解析の過程で既報にない新たな IKZF1 のアイソフォームを明らかにした。IKZF1 遺伝子異常は、DNA 欠失に由来するのみならず、スプライシングの異常やサブクローンに由来するものなど多様に認められた。また IKZF1 の異常は成人 B-ALL において小児ほど予後に影響を与えるものではなかった。これらは成人 B-ALL の病因・病態の複雑性を示唆し、さらなる異なる遺伝子異常の検索が今後も必要であると考えられる。 27 11. 参考文献 1. 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