がん特異性を測る軟寒天コロニー形成の定量的評価鹿児島大学大学院医歯学総合研究科分子腫瘍学古川龍彦 1 従来技術とその問題点 • 軟寒天コロニー形成アッセイは、in vitro で行う腫瘍形成能のアッセイである。 • 従来の一般的な方法ではコロニーを数えているが、立体性があり正確な定量化、多検体処理は困難であった。 • 現存する定量化キットの方法では不溶性のホルマザンを形成するテトラゾリウム塩（MTT）やDNA結合性の蛍光色素をも用いて定量化を図っているが、 • 寒天中のコロニーと細胞を溶かすためにヨウ化ナトリウムと界面活性剤の添加を必要とし全体量が増加するうえ、粘調な液体の一部を採るので精度が悪い、煩雑で多検体の処理も困難である。 2 軟寒天コロニー形成アッセイ • 癌研究は動物実験を細胞培養で代替えすることで大きく進歩した。 • In vitro で上皮性がん細胞がガン化によって獲得する性質として、足場非依存的増殖能を持つことがあげられる。 • 軟寒天コ口ニー形成アッセイはコ口ニー形成の有無を調べることで足場非依存性の増殖能力を調べる方法で、腫傷形成能とよく相関する in vitro のアッセイ系として認められてきた。 3 定量化の問題 • 軟寒天コ口ニー形成アッセイでは一般的には細胞を染色して肉眼的に半定量的に判定していた。 • 細胞が立体的に増殖するので定量化は困難であった 4 新技術の内容 1. 2. 3. 容器底面の寒天上に細胞を含む軟寒天を重層し、細胞を含む寒天の上部に培地を重層し、細胞を培養する工程と（低吸着性プレートを用いれば省くことができる）培地を除去し、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと電子キャリアーとを添加し、細胞を培養する水溶性ホルマザンの発色を指標として細胞の生存を評価する方法。ここで、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムは 2-(4- ヨードフェニル )-3-(4- ニトロフェニル )-5-(2,4- ジスルホフェニル )-2H- テトラゾリウム・モノナトリウム塩で、電子キャリアーが 1- メトキシ -5- メチルフェナジニウムメチルサルフェートである。 5 具体的アッセイ方法 • 96well - plate = 8 x 12 well • ボトムの寒天（ 0.5 – 0.6 % in medium ) • 軟寒天（ 0.4 % )に細胞を捲く（数万千個）軟寒天中ではスフエロイド培養、インビボに近い培養状態である。硬い底面寒天：低吸着性コントロール接着状態の細胞スフエロイド x40 薬剤を作用 6 従来法、A社製品との比較定量性培養日数本法軟寒天コロニー形成アッセイ（従来法）Ａ社製品ＡＡ社製品Ｂあり６－８日半定量２週間以上あり６－８日あり６－８日培地の除去色素の添加コロニーの染色測定前処理（ステップ数）１ 2 測定前処理時間データのバラツキ１時間１０分小さい価格約1000円/88測定 11.3円/１測定ーー培地を除く、寒天の融解、寒天の融解、ピペッピペッティング、界面活性ティング、100μＬを移剤を加える、インキュベーす、ＭＴＴと混ぜる、イション、10μＬを移す、蛍光ンキュベーション、界色と混合面活性剤を加える、インキュベーション、 9 ピペッティング 8 4-8時間以上２時間以上ＮＤ大きい 9030円/98測定１１６５５０円／９８測 921円/１測定定蛍光のプレートリーダー 1189円/98測定が必要 7 新技術の特徴・従来技術との比較 • 従来技術の問題点であった、多検体の解析時の精度の低さ、操作の煩雑さを大幅に改良することに成功した。 • 本技術の適用により、特別な試薬を必要としないので、これらの品質管理に費用がかかってもコストが1/10以下に削減されることが期待される。 8 実施例 1 本方法を使用した癌細胞 (DU145 細胞及び Panc1 細胞 ) の増殖における細胞数と定量性の評価 WST-1/ 1-methoxy PMS 細胞数と相関する OD 値 100 μl の 10 ％ウシ胎児血清含有 RPMI 培地 100 μM の抗癌剤 Paclitaxel を含む培地 DDW：滅菌蒸留水 9 実施例2 癌細胞 (DU145 細胞 ) に対する抗癌剤 Paclitaxel による濃度依存的コロニー形成抑制効果 10 実施例 3 本方法を使用した癌細胞 (DU145 細胞 ) に対する新規抗癌剤候補分子による濃度依存的コロニー形成抑制効果新規の化学物質 A 、 B 、及び C 1 : 0.5 1 : 0.5 1 : 0.5 11 本技術の有用性 • 阻害効果の評価で、細胞毒性ではなく、阻害作用を高感度でアッセイできた。 12 これまでの抗がん剤スクリーニングと現在のスクリーニングのニッチ従来のスクリーニング分子標的治療薬のスクリーニング細胞生存アッセイ細胞の増殖抑制度を測る欠点：毒性との区別が困難、・毒性の高いものがとれやすい・毒性に低いもの省かれる。生化学的な阻害効果が重視される：増殖抑制が見られるかどうかは直接にはわからない。欠点：未知の分子標的の分子では作用できない。増殖抑制と直結しない。特定の作用分子のみに適用 13 軟寒天細胞生存アッセイはスクリーニングのニッチを補う細胞毒性によるスクリーニング毒性の低い物を取りこぼす分子標的治療薬のスクリーニング標的分子の同定が必要軟寒天細胞生存アッセイはこれらのニッチを補う可能性がある・作用する標的分子がわからなくても、アッセイできる。・細胞毒性が低く、増殖抑制効果が高いものを選べる・in vivo 腫瘍増殖に近い。 14 実用化に向けた課題１ • アッセに用いる寒天、プレート、テトラゾリウムの条件の詳細な検討。 • 実用化に向けて、製品の精度管理をできるよう技術を確立する必要も。 • 低吸着プレートを応用し、操作を単純化する。（ボトムの寒天が必要なくなる。底面での細胞増殖を除ける） 15 実用化に向けた課題２ • IPS細胞の腫瘍化の判定条件について、本技術の導入についてはIPS細胞を用いた条件の検討が必要である。 16 企業への期待１ • グローバルスタンダードとなる、アッセイキットとして育てることを目指す。水溶性ホルマザンを形成するテトラゾリウムや低吸着プレートなどの製造メーカーを想定しています。 • 多検体を処理するロボット化可能なアッセイ条件の設定：寒天の粘調性、上清の除去などの問題点を解決したアッセイ系を作製し、ハイスループットなアッセイを目指す。 17 企業への期待２ • 低分子orientedに抗腫瘍薬剤スクリーニングをめざす企業、IPS細胞の腫瘍化判定について、本技術の導入が有効と思われる。 • 足場非依存的増殖に用いる細胞系の確立、分子機構の解明への援助。 18 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称 :水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムを用いた定量的軟寒天コロニー形成アッセイ • 出願番号 • 出願人 • 発明者 :特願2011-219433 :国立大学法人鹿児島大学 :古川龍彦 19 お問い合わせ先鹿児島大学産学官連携推進センター知的財産部門ＴＥＬ: ０９９－２８５－３８８１ＦＡＸ: ０９９－２８５－３８８６ e-mail: tizai＠kuas.kagoshima-u.ac.jp 20