論文審査の結果の要旨 氏名：永山 矩美子 博士の専攻分野の名称：博士（獣医学） 論文題名：牛に子宮内感染するウイルス病に関する研究 審査委員： （主 査） 教授 泉對 博 （副 査） 教授 遠矢 幸伸 教授 堀北 哲也 牛の繁殖障害は、子牛の下痢、肺炎とともに、酪農家に甚大な経済的被害を与えている。胎子は母 体内に存在することで外界からの病原体の感染から守られているが、成獣と比べ病原体に対する感受 性が高く、成獣では病原性を示さない微生物の感染によっても影響を受ける。成牛が感染した場合は 軽度の症状を呈して終わる病原体でも、妊娠牛に感染すると容易に胎盤感染が成立し、繁殖障害の原 因となる病原体が多数報告されている。最近は特に節足動物媒介ウイルスでこの研究が行われ、シュ マレンベルクウイルス、シャモンダウイルス、サシュペリウイルス、ピートンウイルスなどの繁殖障 害となる病原体が報告されている。しかし、感染牛から直接・間接接触あるいは空気伝播により感染 するウイルスでも、垂直感染を起こすものがある。畜産現場では感染症が疑われる原因不明な流産が 多数報告されている。そこで、2009 年度から 2014 年度にかけて生物学的製剤製造のため諸外国から 日本に輸入され、当研究室が病原体の混入や抗体保有状況の調査を依頼された牛血清およびその胎子 血清を使用し、牛ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）抗体保有状況および持続感染牛の検出を試みる とともに、それ以外の混入ウイルスの分離を試み、子宮内感染により繁殖障害の原因となる可能性の あるウイルスの調査を行った。 1. 牛胎子血清からのウイルス分離とその同定 繁殖障害を起こすウイルスとして日本をはじめ世界各地で問題となっているウイルスは BVDV であ る。また、既報の牛胎子血清（FBS）の抗体調査では FBS からは BVDV 以外のウイルス抗体も検出 されている。BVDV 以外のこれらウイルスの持続感染牛が生まれるという報告はないが、一時的なウ イルス血症を起こすことで繁殖障害の原因となっている可能性は高い。そこで、ニュージーランド （NZL）、オーストラリアおよびドミニカ共和国の各国で採取され、細胞培養に使用する FBS 製造の ため日本へ輸送された 2,758 個体の FBS を使用して BVDV の分離を行うとともに、牛胎子筋肉由来 初代（BFM）細胞、牛腎臓由来株化（MDBK）細胞およびハムスター肺由来株化（HL）細胞の 3 種 の細胞を用いて細胞変性効果（CPE）を指標として、その他のウイルスの分離も試みた。CPE が確認 できなかった検体では blind passage を 2 回繰り返した。BVDV の分離は、検査血清を 20％含む培養 液と BFM 細胞を混合培養し、5 日後に細胞病原性 Nose 株を重感染させる干渉法を使用した。その結 果、BVDV は 25 検体の FBS（0.91％）から分離され、CPE を起こすウイルスが NZL 産 1 個体、オ ーストラリア産 20 個体の FBS から分離された。感染細胞をギムザ染色して観察すると、細胞が円形 化して脱落するとともに多数の巨細胞の形成が認められた。理化学的性状を探索すると、エンベロー プのある 100 から 200nm の RNA ウイルスであることが確認された。分離ウイルスの同定のため、 cDNA を使用して次世代シーケンサーを用いた遺伝子解析を行った結果、分離したウイルスは全て牛 パラインフルエンザ 3 型（BPIV-3）であることが判明した。 2. FBS を使用した BVDV 子宮内感染の調査 研究 1 で FBS から分離した BVDV の遺伝子解析を行うともに、これらの FBS を用いて BVDV の 1 抗体検査を行い、野外における BVDV の牛胎子への垂直感染の実態を調査した。BVDV 抗体検査は、 2 倍階段希釈をした検査血清と 100TCID50 のウイルス抗原を混合し、37℃で 1 時間放置後 BFM 細胞 浮遊液を加える同時接種法による中和試験を行い、5 日後に CPE の出現を指標に抗体価を測定した。 ウイルス抗原には BVDV Ⅰ型 Nose 株、KS86 株および BVDV Ⅱ型 KZ-91 株を用いた。分離した BVDV の遺伝子解析を行ったところ、2011 年 NZL 産のひとつは 1a、オーストラリア産血清のふたつ は 1c のクラスターに含まれ、これら以外は 1d に近縁であった。また、BVDV 抗体は 44 検体（1.60％） から検出された。数個体の FBS を Pool したドミニカ共和国の血清は 1 検体中に複数の陽性個体が存 在した可能性があることは否定できないが、BVDV 分離率と抗体陽性率を合計しても約 2.5％なので、 その可能性は非常に低いと考えられる。牛胎子は発生初期に BVDV に感染すると死亡や流産が生じる ため、血清採取の胎齢となるまで発育した胎子を使用した今回の調査では、死流産を起こした胎子感 染の頻度は解明できない。妊娠牛が約 280 日の妊娠期間で BVDV に感染する可能性に差が無いと仮定 すると、死流産は主に胎齢 40 日以内の胎子で起こるため、この期間に流産が 0.5-0.8％程度発生して いたことになり、BVDV の子宮内感染は自然界で約 3.0％の妊娠牛に起きていることが示唆された。 NZL の一農場から採取した牛胎子血清 139 検体は、母牛の血清とペア血清で入手できた。これらの母 牛血清は 1 頭を除いて BVDV 抗体陽性で、すべての牛胎子血清は BVDV 抗体、BVDV 分離試験とも に陰性であった。つまり受精時に既に抗体陽性の牛から生まれる牛胎子は BVDV の子宮内感染を免れ ていることが示唆された。市販されている FBS は 200～500 頭の FBS を Pool して製品にしているた め、この検査結果により、BVDV 抗体陰性の血清を入手することが困難であり、数多くの細胞に BVDV の汚染がある現状が裏付けられた。 3. BPIV-3 の垂直感染および免疫寛容牛の調査 BPIV-3 も子宮内感染が成立することが示唆されたので、その頻度を確認するため、NZL 産、オー ストラリア産の約 1000 個体の FBS を使用して BPIV-3 の抗体検査を行った。抗体検査は 2 倍階段希 釈した検査血清に感染価を 100TCID50 に調整した BPIV-3 BN-1 株を混合し、37℃で 1 時間放置後に MDBK 細胞浮遊液を加える同時接種法による中和試験で行った。その結果、BPIV-3 の抗体を持つ胎 子は一個体も確認できなかった。BVDV は粘膜上皮細胞とともに末梢白血球にも感染しているが、 BPIV-3 は粘膜上皮細胞を標的細胞とする。従って、牛胎子に胎盤が形成される胎齢 80 日齢以降では BPIV-3 の子宮内感染は起こりにくいと思われる。妊娠後期の BPIV-3 抗体陰性母牛に BPIV-3 を静脈 内接種しても胎子が感染しなかったという報告もある。従って、ウイルス血症を起こしていた牛胎子 は妊娠前期に感染を受けていると考えられる。つまり牛胎子が妊娠初期に BPIV-3 に子宮内感染した場 合、死流産することなく持続感染した状態で母体内で成長を続ける可能性が示唆された。BPIV-3 の免 疫寛容牛の存在を調査するために、BPIV-3 のワクチン接種を定期的に行っている 2 農場およびワクチ ン未接種であるが BPIV-3 の流行が確認された 1 農場の牛血清を使用して BPIV-3 の抗体価を測定した ところ、大部分の牛が 256 以上の抗体価を保有していたが、成牛で抗体価の低い個体が少数ではある が検出された。また、これらの個体の BVDV 抗体産生能は正常であり、免疫機能異常である可能性は 低い。これらの牛の末梢血白血球、鼻汁、唾液から BPIV-3 の分離を試みているが、現時点では分離で きてない。 BPIV-3 が BVDV と同様に牛胎子に免疫寛容を成立させる病原性を持つかは不明であり、今回のウ イルス分離が牛胎子の一時的なウイルス血症によるものか持続感染が成立したことによるかは明らか ではない。しかし妊娠中期の牛で BPIV-3 の子宮内感染が起こること、および BPIV-3 の持続感染牛が 誕生する可能性が示唆された。 総括 野外における牛のウイルス病の感染状況の調査は成牛を使用したものが大部分であり、垂直感染の 調査でも、初乳未摂取の新生牛を使用したものが多い。本研究はウイルス性疾病が疑われる牛の流産 の原因を究明することを目的に、牛胎子血清を使用してウイルス分離を試み、分離されたウイルスに 対する抗体保有状況を調査した。2500 検体以上の牛胎子血清を使用した大規模なスケールにより野外 での BVDV の子宮内汚染状況が確認され、現在でも一定の割合で BVDV の感染源となる持続感染牛 が出生していることが示された。そして適切なワクチン接種により妊娠前に免疫を保持させておけば BVDV の子宮内感染が制御できることが示唆された。 世界各地においてその存在が確認される BVDV の流行状況を把握することができた。今回の FBS 2 採材地域では BVDV 1d の流行が主であり、1a、1c の存在も確認できた。また、現時点では子宮内感 染をするウイルスとしての存在認識が希薄である BPIV-3 をオーストラリア産胎子血清から分離し、子 宮内感染をするウイルス病としてその存在を再認識することができた。 しかし BPIV-3 の持続感染牛は摘発できなかった。これは、牛胎子が出生する以前に流産・死産して しまう可能性や、出産した持続感染牛も長時間の輸送や急激な気候変化などのストレスを受けないと 一定量のウイルス排泄が生じない可能性がある。また、BPIV-3 の野外材料からの分離は 33～35℃で の回転培養が必要で他のウイルスと比べ分離が困難なことが考えられる。しかし BPIV-3 のワクチン接 種牛で抗体価が上昇しない牛が存在することは、BPIV-3 の免疫寛容牛が存在する可能性を示唆してい る。 現在、大部分の急性のウイルス病はその感染様式や病原性が解明され、その予防法も開発されてい る。しかし病原性が弱いと判断されて予防対策が取られてない、病原ウイルスとして扱われてないウ イルスでも、胎子には病原性を示すウイルスが存在し、子宮内感染を起こせば繁殖障害の原因になる と思われる。この種の病原体による疾病には未解明のものが多数存在していると思われる。今回試み た牛胎子血清を使用したウイルス病の疫学調査が、子宮内感染により繁殖障害を起こす疾病の解明に 活用されることが期待される。 よって本論文は，博士（獣医学）の学位を授与されるに値するものと認められる。 以 平 成 ２８年 ２月 ４日 3 上
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