Title Author(s) Citation Issue Date Type ストロボスコープ型遠心顕微鏡の試作とその細胞生物学への適用上坪, 英治一橋論叢, 96(6): 791-797 1986-12-01 Departmental Bulletin Paper Text Version publisher URL http://hdl.handle.net/10086/12748 Right Hitotsubashi University Repository （125）研究ノート︽研究ノート︾英治ストロボスコープ型遠心顕徴鏡の試作とその細胞生物学への適用上坪遠心顕微鏡︵8鼻・巨oqo邑o旨m8喝一〇室ω︶は、任意の遠心加速度場における細胞およびその部分の状態・挙動などを光学ンズ一〇・二〇倍、接眼レンズ一〇倍を搭載するため、試料の＾1︶ピデオCMS︵テレビジ目ンCMS︶の光学系は、対物レボ機構の遠隔操作により、ローター回転中の試料の照準．遠心中程度の拡大が可能である。回転子︵・9昌︶に内臓されたサーへの走査ができないことは、実験・観測をおこなう上で重大な︵求心︶方向への走査も可能である。しかし、試料の接線方向支障をきたす。試料の種類・サイズ等も大幅に制約される。ローター回転中にコンデンサー絞りの開閉が出来ないことも惜しまれる。ローター重量が大きいため、その回転数−すなわち加速度を保つのは容易である。遠心加速度の急速な増減は不可能である。ただし、一定の遠心上坪によって新たに老案されたストロボスコープ型CMSは、心・接線両方向の走査、コンデンサー絞りの開閉が可能である。ローター回転中に通常の光学顕微鏡と同様に試料の照準と遠光学系の分解能は従来の機種のいずれよりも高い。遠心加速度顕徴鏡観察するための装置である。これによって、細胞およぴその部分の主として物理的諸性質ーたとえぱゾウリムシの細本論叢に解説した︹m︺。各種のCMSの原理・構造・機能等の詳細については、先にる。測・実験が可能となり、また比較的容易となることが期待され他のCMSでは不可能もしくは著しく困難であった各種の観ことを意味する。以上のことから、ストロボ型CMSによれぱ、ある遠心加遠度場における温度の影響をみることが容易であるの急速な制御も自由自在である。ローターおよぴ試料の温度は＾2︶室温と等しく、回転にともなう上昇の懸念がない。このことは、胞質の粘性︹1︺、ウニ卵の表面カ︹2︺などを測寅すること 5，6，7，8，9︺。ができる。また、種々の生理学的研究に用いられる︹3，4，遠心顕微鏡︵以下CMSと賂す︶にはブラウン型．ハーヴェイ型・ピデオ型の三種類が知られていた。このうち、ハーヴェイ型のものは現在ほとん。ど稼動しておらず、新たな製造．販売もされていないo ブラウン型CMSは、原理・構造ともに単純で、簡易な使用〇倍程度︶に限定される。法と相侯って極めて有用であるが、光学系が低倍率︵綜合一〇 791 第6号（126）第96巻一橋論叢ストロボ型CMS試作上の問題点画像の静止も良好である。が必須である。試料位置検出センサー︵タイミングセンサー︶ストロボ光源を発光させる。このため、試料位置の正確な検出ストロボ型CMSでは、試料が対物レンズ直下に来た瞬間にを踏まえ、八一年秋ストロボ型CMSの試作に着手し、八五年一九八○年から翌八一年にかけておこなった予傭試験の結果審一応の完成をみた︹11︺。基本設計・組立て・調整・試運転クターを試用したが、応答速度やや遅く、かつ外部ノイズ光にとして、発光ダイオード・フォトトランジスタ型フォトリフレよる誤信号を出し、像の不連続な跳ぴや誰止不良の原因となっを繁者が担当、トリガーバルス発生回路・電子回転計その他の学︶が分担、光学系およぴ回転子系等の機械部分の設計・製作電気回路都分の設計と製作を菊山宗弘理博︵新潟薬大・物理化ブ製︶にとり換え、ローター回転軸に関し対物レンズとほぼ対センサーを位置検出特性の良いフォトインタラプター︵シャーた。その後、浜松ホトニクス︵株︶犬橋義春氏の提案により、と援助がありた。称位置にラヅクピニヨンによって支持した。ローターの試料容はニッコーエンジニアリング︵株︶がおこなった。多くの協カには種々の技術的困難があった。とりわけ、この方式にとってストロボ型CMSの原理は極めて単純であるが、その実用化通過するとき、同時にビンがフォトペンタヲプターを通過し、トプレー力1︶を固定した︵図1︶。試料が対物レンズ直下を器セット溝正反対側に、ローター半径の延長方向にビン︵フォビニ目ンによりローターの接線方向に動かせぱ、試料の接線方基本的に重要な、つぎの二点について記録しておく。当初、光源として菅原製作所製ストロボ装置﹁ナノバルサ﹂︵アルゴン水素放電管、発光時間七五ナノ秒︶を試用したが、は自由︶。ローター回転数毎分八○O∼五〇〇〇回、得られる X三四X三ミリメートル︵この範囲内であれぱ容器のデザイン五−四〇、・、リメートル、試料容器セソト溝の幅・長・深さ一〇回転子系▽口ーター半径五〇、ミリメートル、宥効遠心半径二完成機の主な仕様はつぎのとおりである。完成した試作機の仕様センサー電流がパルス発生回路に送られる。センサーをラックジヅター︵旨津實︶が長く︵最犬三〇〇ナノ秒︶、かつ再現性悪向の走査を自由におこなうことができる。＾3︶く、そのため遠心下の試料顕微鏡像の静止不良を来たした。また、使用中、アルゴン水素混合ガス圧︵定格二・五気圧︶が突からガスを注入しなけれぱならなかった。止むを得ず、原理的然低下し︵放電停止←実験の中断︶、その都度、付属のボンペには不利であるが、発光時間の長い︵一五〇ナノ秒︶キセノン放電管を用いることにした。キセノン管のジッターは約三〇ナノ秒でほぼ一定、輝度もアルゴン水繋管より高く︵約二倍︶、ガス封入型であるため前記のようなガスのリークはおこらない。 792 （127）研究ノートさしたる影響はない。野絞りは芯出し機構を欠くため取り外したが、光挙系の性能にピデオカメラおよぴVTR系▽遠心加遠度場における試料の〇x9︵二〇倍対物レンズ使用の場合は最高毎分一〇〇〇〇回転・約四五〇〇×g︶。回転数はローター一回転．ことに出るト顕微鏡像は、通常、ピデオカメラ︵池上通信機CTC二六〇〇遠心加速度は遠心半径四〇ミリメートルのとき三〇：約一〇〇リガーパルス信号を毎分当りの回転数︵RPM︶に変換し、タスーパーカルニコン撮像管またはナシ百ナルwVl一五五〇ルト駆動。モーター回転数の制御はスライダヅク︵二連︶によれる。モニターにはローター回転数およぴピデオタイマー︵朋コントラストを適当に増強したのちピデオモニター上に表示さ必要に応じレコードブースター︵朋栄RB−一〇R︶によって二＾ーピコン撮像管︶により対物レンズ一次像を直接撮像し、イトルジエネレーター︵朋栄TGI一六〇︶によってピデオモニター上にリアルタイムでディジタル表示する。ローターの回り供給電圧を昇降させておこなう。ローター重量は約一二一グ栄VTGI八八︶による時間︵年月日時分秒︶が同時にスーバ転は整流子モーター︵ナシ目ナルSSCl八二一C︶によるベラム︵試料容器・カゥンターバランスを負荷して約一一四グラーインポーズされる。モニター画像は随時VTR︵ピクターU ーグラス厚み補正環つき。照明法、明視野・ノマルスキー微分 DIC︵長作動距離、開口数○、五五︶、二〇・四〇倍はカバ試料像を直視しつつVTR記録することも可能である。ロータ応じ、対物レンズとピデオカメラの間にファインダーを挿入し、三〇︶に録画され、反復再生して解析される︵図1︶。必要にマチックカセットcR1六〇六〇またはナシ目ナルNv1八〇ム︶であり、モーター回転数の変化に即時追随する。干渉︵対物レンズニ○倍のとき有効、四〇倍では光源輝度不足︶、こなう。実験条件その他同時記録のためにはVTRの録音機能ー停止中の試料の観察は、ストロボを五〇ヘルツで放電してお光学系▽対物レンズ、ニコンCF一〇・二〇DIC・四〇〇、一五倍。コンデンサー、ニコン長作動距離︵開口数O、五アウトしてレンズ交換をおこなう。この機構は実際には極めて対物レンズの倍率変換は、鏡筒をアーム軸まわりにスイングが、一年半の試用中に若干の間題点を見出した。世界初のストロボ型CMSは上記のように一応の完成をみた改良を要する点を利用する。位相差は割愛。直接観察の場合の接眼レンズ、ニコンCFW一二︶。試料の照準、直進ヘリコイド方式。試料の走査、遠心方向は光学系全体の移動による︵回転軸から二五∼四〇ミリメートル︶。走査位置︵対物レンズの位置、遠心半径︶は光学系を積んだスライディングステージの移動用マイクロメーターによって読みとる。接線方向の走査はタイミングセンサーの移動による。走査幅は約一〇、ミリメートル。遠心・接線両方向の走査を同時におこなうことも容易である。光源、前述のとおり。視 793 第6号（128）第96巻一橋論叢ンズ交換をおこなっている。将来、レボルバー方式に改めると、き良好、四〇倍では不良であった。同期させるものであるが、テスト緒果は対物レンズニ○倍のとピデオカメラ制御系へ送り、ストロボの放電とカメラの走査をは、ストロボ制御装置へ送るトリガiパルスを分岐して同時にワンタヅチで倍率変換が可能となる。最近、高性能で比較的安価な画像処理装置が普及しつつある。不便である。当座の解決策として、鏡筒を垂直にひき上げてレが不足である。対策として超高感度ビデオカメラの使用が考え日本アピオニクス︵株︶のイメージシグマを借用してバーノイ、ス消去を試みたところ、極めて良好な結果が得られた。ノイズ四〇倍対物レンズ使用時に、微分千渉照明のための光源輝度られるが、画質が低下するため望ましくない。明視野照明法に絶大な効果があった。除去のみならず、像コントラストの増強・画質の改善などにもおいては、光源輝度・カメラ感度ともに十分であるから、この間題はむしろ画像処理によって解決を図るのが上策である。ー画面を上下に移動して現象の観渕・解析を妨害する。解決法生じる。バーの数はローター回転数に応じて増減しつつモニタ平本ら︹2︺はムラサキウニ未受精卵を用い、種々の遠心加二・三の研究がおこなわれ、若干の知見が得られた。一九八五年二月以降、ストロボ型CMSの性能試験を兼ねてストロボ型CMSによる新知見 CMS像をピデオカメラによってモニター・録画する場合、回ーター回転数とピデオカメラの走査︵毎秒六〇フィールド、を種々試みた結果、コンデンサー絞りを十分絞りこむことによってバーノイズはほとんど無視できる程度になることを見出し面カ︵H雪9昌g9Φ8自蜆胃h富o︶として○、〇四ダイン／速度場における卵の変形をピデオ記録し、その変形度から卵表三〇駒︶とが同期しないため、モニター画面上にパーノイズがた。この方法は、モニター画像のコントラストを滅少させ︵光際はその分解能を低下させる。ただし、試料の性質・実験目的バフンゥニ卵について押しつぷし法で得た値︵○、〇三ダインセンチメートルという値を得た。これは平本︵一九六三年︶が一、ウニ卵表面力の測定挙系のみの直視観察では増大する︶、四〇倍対物レンズ使用の等によってははなはだ有用である。二、原形質流動停止と細胞質の粘性変化車軸藻類節間細胞は電気刺激によって興奮し活動電位を発生／センチメートル︶に極めて近い。の映像信号を電気的に微分することによってバーを消去するも回復する。流動停止の原因として、細胞質粘性の上昇説︹12︺する。これに伴い原形質流動が瞬間的に停止し、五∼十分後にバーノイズ消去について、浜松ホトニクス︵株︶の大橋義春ので、可成り有効である。ただしモニター画面が暗くなる欠点氏は二つの案を示し、かつ実施された。一つは、ピデオカメラがあり、特に高倍率観察の場合それがいちじるしい。第二の案 794 （129）研3宅ノ’トルクの細胞質の粘性は変化しないという。部分鉛処理法と電気と流鋤原動カの一時消失説︹13︺とがある。後者は停止時にバ必要な油球の密度は、純水中における油球の移励速度を適当なトークスの式によって内質の見かけの粘度を算出した。計算に一〇∼数一〇Qセンチポァズであり、ずり遠度の増加とともに得られた内質の見かけの粘度は、ずり遠度毎秒一∼一〇で数︹17︺の値を用いた。遠心加速度下で測定して求めた。内質の密度は神谷・黒囲前者を支持する︹14︺。刺激の組合わせによって誘起されるUターン現象は、間接的に低遠心加遠度︵約五〇X9︶下のミルフラスモ節閲細胞を、質申に存在する種々の”構造。がその進路を妨げたためと考え減少する。油球が一定速度で移動しない例が多数あったが、内圧電繋子によって非接触電気刺激すると、細胞皮層部︵動因座のいずれに向かうものも瞬間的に停止し、数秒ないし一〇数秒近傍︶の紬胞質願粒は、申立線をへだてて遠心方向・求心方向お、バルクの内質と嚇因座繊維との界面︵いわゆるゾル・ゲルられる。これらの構造がなんであるかは目下検討申である。な界面︶の粘度は、毎秒五〇∼八○のずり遠度のために著しく低間静止︵粘性の犬幅な上昇？︶したのち、徐々に運動を再開すて一且停止したのち遠心端に向け後退する場合がある︵粘性低いと思われるが、詳くは別途研究する必要がある。以上、上坪る。動因座よりやや内側を求心端に向かう願粒は、刺激によっ下か？︶︹正、16︺。以上の知見は二〇倍対物レンズを用いて得四、嫌皮動物卵細胞質のカ学的性質と金田による︹18︺。ラ︶卵細胞質の初期発生における硬さの時間的変化・局所的差金田ら︹19︺は、嫌皮動物︵イトマキヒトデ、タコノマクられた。より詳細を知るぺく四〇倍対物レンズを用いて研究継三、車軸藻類紬胞質内質の粘度測定続中である。ミルフラスモ節間細胞をブラウン型CMSによって遠心処理このような細胞をストロボ型CMSによってさらに遠心する有物が分層される。同域では数時間原形質流動がおこらない。卵のそれと等しくした。を用いて粘度を求めた。なお、海水の密度はパーコルを用いて遠心方向に移動する。この移動速度を測定し、ストークスの式 gの遠心カをかけると、金徴小球は紬胞質との比重差によってーター︶をガラス徴小針で挿入し、紬胞全体に五〇∼五〇〇x と、分層した葉緑体や核の間陳に混在する内質から油球︵直径異を測定した。細胞質内に金の微小球︵直径三∼六マイクロメ約一〇マイクロメーター︶が抜け出し、葉緑体・核の上に重畳から、従来の各種の方法によって得られた知見と較ぺ、より優現在データの解析が進行中であるが、本研究法の高い分解能し、遠心端部に葉緑体剥落域をつくる。剣落域には、遠心端かした内質の中を求心端に向かって移動する。この油球の移動速ら順に葉緑体・核・細胞質内質・トノプラストを介して液胞含度を大小の遠心加速度場︵一〇〇∼四〇〇X9︶で測定し、ス 795 ■ 一橘論叢第96巻第6号（130）れた結果が期待される。︹1︺ d昌峯∼界声−．一−．向Xや︸一〇一’ミωミ︵岩き︶文献︹2︺雪量昌o員＜．彗O声く9＆三−タ量o庄oaぎ8＝旨o−︵H謁α︶巨〇一〇簑一ミ一‡少向p↓1■．ωo葦註8＞s3邑o勺﹃o詔謝辞記して厚く感謝します。順不同。三鬼エンヂニアリング︵株︶ Hoξoしp塞㎞︵岩8︶︹4︺︸ξ轟貝Hl二〇ざ葦勺岩Φ易Oo昌．Ω實．畠．O邑く．︵5轟︶︹3︺宍葭邑事オー彗︷界宍胃o註一軍o♂亘霧目芭一さ−案ストロボ型CMSの試作に当り、次の方々の御協カを得た。︹現MSDサプライ︵株︶︺申川久史氏︵回転数表示回路︶、クォンテル︵株︶西子雅美氏︵レコードプースター、ノイズ防止ピデオカメラ徴分回路その他︶、新潟薬大菊山宗弘氏︵トリガ等︶、浜松ホトニクス︵株︶犬橘義春氏︵タイミングセンサー、︹6︺穴因昌豪き9向∴雪9o亘顯竃Pぶ3︵5S︶︹5︺宍纈昌豪亭9戸一勺8o﹄岩與目＞o邑．き一8N︵s象︶︹7︺丙葭昌茅亭9向−一巨9＝峯g一一身一量〇一〇邑鶉彗o ーバルス回路、電子回転計その他︶。御励ましをいただいた大阪大学名誉教授・日本学士院会員神 ○轟與昌■算−o冒 N︷H一向o眈一ω．匡芭冨昌o 9芭ポO昌く一Ho片︸o 谷宣郎先生、東犬︵現茨城大︶教授林俊郎氏、犬阪市大教授増牢鶉9Ho耳o︵5s︶二N︵5ooα︶︹9︺宍胃o量宍．9巴一掌oo．﹄岩彗ぎ邑．員ω彗申︵H湯H︶︹8︺穴胃o旨一宍．竃q字宍顯目一這一里o︸8一〇岬さ員aω 田芳雄氏にお礼申し上げます。なされた。本研究の一都は文部省科研費試験研究︵二︶援助金によって︵1︶文献︹8︺における名称。文献︹9︺ではく巳88宇区h品o邑go閉8潟と改称。︹u︺菊山宗弘・上坪英治一圓本植物挙会第五〇回大会︵新︹10︺上坪英治一一橋諭叢、八六︵六︶、一一七︵一九八一︶︵2︶ピデオCMSではローターがガード容器内にほぼ密閉ー・試料︶の温度が上昇する。これを避けるために、別に︹13︺ぎ墨轟一竃．竃q戸匿邑目o8一里竃一淳Oo二雲㌣− ︹12︺ O監竃一ω．一手8せ鶉昌︸一ふH竃︵乞轟︶潟︶講演要旨二一九員︵一九八五︶されているため、ローター回転にともない容器内︵回ータ設けた冷却装置から容器内へ冷風を送る。間差。︵3︶励起信号が入ってから放電管の発光のビークまでの時色o−−一〇一蟹H︵岩亀︶ 796 （131）研究ノー｝︹〃︺内纈目岸岬目σ9■．“O固P −．■O庁一1︸戸Nαo ︵−ΦNΦ︶ p ︹15︺上坪英治・菊山宗弘一圓本植物挙会第五〇回大会︵新 G 潟︶講演要旨二五七頁︵一九八五︶︹脆︺ −︵曽目一岸蜆目σO−向．“﹄．峯冒mo−o 射o叩‘ Oo＝買o匡−J “ NNα ︹ーア︺賓胃ξぷ21彗ρ穴−肉胃＆四一厚oo−﹄毫彗＞o邑・§一︵H凄ひ︶︹18︺上坪英治・金困勇一目本植物学会第五一回大会︵鹿児 A−D 山一 ■I C XT 米 N ♂ ω ︵ − 温 N ︶ VTR 肥︹19︺金囲勇・上坪英治・平本幸男一第三九回目本細胞生物 τ VT 島︶講演要旨二一八頁︵一九八六︶挙会大会︵東京︶講演要旨七一頁︵一九八六︶図ーストロボ型遠心顕徴鏡コローター、冨一タイミングセンサー、埋H一パルス発生回路兼電子回転計、ω9ストロボ制御装置、×H一キセノン放レンズ・く？ピデオカメラ、＜09ピデオカメラ制御装置、電管、？コンデンサー、竺試料容器中の試料、O亘一対物射■“レコードブースター、＜↓一ピデオタイマー、↓〇一タイトルジェネレーター、くH宛一ビデオテープレコーダー、ニター、弓一函像処理装置。ローター駆動装置は省略。説＞−U一アナログ・ディジタルコンバーター、＜峯一ピデオモ明は本文。︵一橘大挙教授︶ 79？ SC P！τ VM 0b r ㎏ VC VCC 1 図