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日本栄養・食糧学会誌第 5
8巻 第 6号
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玄l
つくば高血圧マウスの血圧に及ぽす
ニコチアナミンの影響
林
あ つ み 中 山 知 子 村 上 和 雄2
青柳康夫九木元幸_~*， 1
(
2
0
0
5年 l月 1
7日受付:2
0
0
5年 6月 5日受理)
要旨:ニコチアナミンはアンギオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害活性を有し，高血圧自然発症ラットへの
長期投与により血圧上昇抑制作用を示すことが報告されている。われわれは，数種の植物中よりニコチアナ
ミンを単離し， HPLC法を用いた植物中のニコチアナミンの迅速簡便な分析方法について確立してきた。
今回はつくば高血圧マウス (THM) を用いてレニンーアンギオテンシン系 (RAS) に対するニコチアナミ
ンの影響について検討した。 THMは
， C57BL/6マウスにヒトレニン遺伝子とアンギオテンシノーゲン遺
伝子を導入することにより作製された高血圧モデル動物であり，高血圧の成因が RASの充進という単一因
子である。われわれは， THMの血竣中ニコチアナミン濃度を定量し，胃内投与後にニコチアナミンが腸管
から吸収され血中に検出されたことを確認した。その結果，ニコチアナミン投与後 6時間まで有意な血圧降
下作用を示した。血竣 ACE活性，さらに肺，腎臓の ACE活性は，ニコチアナミンの投与により低下した。
ニコチアナミンが吸収されたことにより ACE活性と血圧を低下させたことが示唆された。
キーワード:ニコチアナミン，つくば高血圧マウス，レニン・アンギオテンシン系，高速液体クロマトグラ
フィー
高血圧はわが国におげる主要死因である心血管系疾患
によって見出され，高血圧自然発症ラット (SHR) を用
の最も重要な危険因子であり， 2
0
0
0年に実施された第 5
次循環器疾患基礎調査によると，
r
高血圧治療ガイドラ
いた降圧作用についても報告されている。しかし，その
作用の直接的な証明はなされていない。そこで今回われ
イン 2
0
0
0年版」による分類を用いた場合，日本人では
われは，ニコチアナミンの降圧作用について調べるため
3
0歳以上の男性のうち約 51.7%，女性は 39.7%が高血
に，投与後のニコチアナミンの追跡を試みた白
つくば高血圧マウス (
Tsukuba h
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圧症であるという結果であった。高血圧を放置すれば脳
卒中，心不全，腎臓病などの合併症を引き起こすため，
THM) はヒトレニン遺伝子を導入した雌性マウスとヒ
これらの疾病を予防するには高血圧をいかに予防，治療
トアンギオテンシノーゲン遺伝子を導入した雄性マウス
するかが重要な課題となっている。最近では，薬剤の投
を交配することにより作製された，ヒトレニンおよびヒ
与により血圧をコントロールすることは比較的容易に
トアンギオテンシノーゲン遺伝子の両遺伝子をもっ，ヒ
なっている D しかし，生活の質を考慮した場合，まず生
トRA系冗進という高血圧の成因が明らかな高血圧モ
活習慣の改善が求められる。非薬物療法については，ア
デル動物である 8)。今回は，この THMにニコチアナミ
メリカ高血圧合同委員会(JNC)1)や WHO/ISH2)
，日
ンを単回胃内投与することにより，生体内におげる RA
本高血圧学会3) などのガイドラインにおいても重要性が
系に対しての降圧作用と，さらにニコチアナミンの生体
強調されている。
内における吸収挙動を探ることを目的として研究を行っ
そこで著者らは以前よりさまざまな植物中の高血圧抑
た
。
制物質について検討を行い 4)5うその物質がニコチアナミ
また，われわれは逆相系カラムを用いた HPLC法に
ンであることを報告してきた九ニコチアナミンはレニ
より迅速簡便に植物中のニコチアナミンを定量する方法
RA) 系のアンギオテンシン変換
ン.アンギオテンシン (
を確立し報告した 6)。今回は，ニコチアナミンの血中へ
酵素 (ACE[EC3.
4.
1
5.
1
]
) を阻害することが木下ら 7)
の吸収挙動を探るために血中ニコチアナミンの分析を試
ネ連絡者・別刷請求先
1 東京家政大学栄養学科 (
1
7
3
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6
0
2東京都板橋区加賀 1
1
8
1
)
3
0
5
0
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6
2つくば市赤塚 5
8
6
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)
2国際科学振興財団 (
3 女子栄養大学保健栄養学科 (
3
5
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2
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8坂戸市千代田 3
9
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1
)
3
1
6
日本栄養・食糧学会誌第 5
8巻 第 6号 (
2
0
0
5
)
みた。血築中の高分子画分を除くために， BSA-ODSの
プレカラムを用いたイオン対クロマトグラフィーによる
高速液体クロマトグラフィーを用いて血中ニコチアナミ
ン濃度を測定した。
実験方法
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e (~株)ペプチド研究所)を 7
m Mとなるように pH8
.
3の 200mMホウ酸緩衝液に溶
解し基質として用いた。基質に 2M NaClを加え，血援
と 3TC30分間反応後， 1 MHClで反応を停止した。酢
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dを撹持抽出し
酸エチルを加えて遊離した H
た後，酢酸エチル層を分取した。濃縮遠心機(タイテッ
1.投与試料
0C減圧下で乾固した後，純水に溶解し
ク(株))にて 6
ニコチアナミンはハヤトウリ (
Sechium e
d
u
l
e
) から
抽出した。精製方法は前報 6) の通り行い，得られた結晶
228nmの吸光度を測定した。 ACE活性 1ユニットは，
3TCで 1分間に 1μmolの基質を分解する酵素量として
を純水に溶解することにより投与試料とした。
表した。
0
2
. 実験動物および投与方法
につきニコチアナミン 1mgを単回胃内投与した。 THM
6
. 組織 ACE活性測定法
0Cで保存したものを，測
組織については採取後一 8
0
0
定 時 ， 氷 中 で 各 組 織 100mgを細切後， 500μLの 2
m Mホウ酸緩衝液， pH8
.
3を加えてミクロハンディー
2，0
0
0rpm
ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。 1
で2
0分間の遠心分離により得られた上清を ACE活性
測定用試料とした。
ACE活性は血壌と同様に測定した。また， Bio-Rad
P
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nassay法 11)によりタンパク量を測定し，データ
を0
，1
，6
，2
4時間後採血群に分げ，それぞれ測定可能
は比活性で表した。
な群について投与後経時的に血圧測定を行った。その後
7
. 統計解析
実験データは，平均値±標準偏差で表した。各群聞の
比較は分散分析 (ANOVA) により平均値の差を検定
unnettの多
後，有意差が認められたものについては， D
重比較により対照群との有意差検定を行った。有意水準
は 5%以下とした口
なお，本動物実験は「実験動物の飼養及び保管等に関
5年 3月，総理府告示第 6号)を遵守
する基準 J(昭和 5
して実施した。
1週齢の雄性 THMを用い
実験には，自家繁殖した 1
3:
t2C，湿度 55:
t5%そして 1
2時間明
た。動物は室温 2
0
0
2
0:0
0
) に保持した飼育室で飼育
暗周期(明期 8:0
繁殖した。飼料(オリエンタル酵母工業側製繁殖用飼料
NMF) および水(滅菌水道水)は自由摂取とした。そ
2時間から
して，飼料摂取の影響を除くため，投与前 1
0gの THM1匹
観察期間中は断餌を行った。体重約 2
0
0rpm，
各群，腹部の大静脈より採血を行い， 4Cで 3，0
0
1
5分間冷却遠心分離して血援を得た。
3
. 血圧測定
血圧は，無麻酔下，非観血法で尾動脈圧測定装置
(~槻ソフトロン BP-98A)
を用いて血圧測定を行った。
4
. 血築中ニコチアナミン濃度の定量
血中ニコチアナミン濃度の定量は，前処理カラムを
用いたイオン対クロマトグラフィーにより行った。前処
理カラムには，東ソー鯛 TSKprecolumnBSA-ODS/S
0
実験結果
t4
.
6x1
0mm) を，分離カラムには東ソー(槻
(
s
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TSK-GELODS80Tm (sizeφ4.6X150mm) を用い
た。対イオンとしてラウリル硫酸ナトリウム (SDS:
和光純薬工業株~)を用いた。 0.1 M SDS
，pH2
.
0
5で平
衡化し，試料を注入し洗浄後溶離液にて溶出した。溶離
.
1M SDS，pH2
.
0
5とアセトニトリルとの混
液には 0
.
7
5mL/min
，カラム温度 3
0Cで 行
液を用い，流量 0
い，アセトニトリル 30-80%のグラジェントにより溶出
した。検出は，ポストカラム誘導体化法により行い，ラ
ベル化試薬として， 0.02% 0-フタルアルデヒド(和光
・メルカプトエタノール(和光
純薬工業(槻)と 0.05%2
.
0を
，
純薬工業(槻)を含む O.lMホウ酸緩衝液， pH9
流量1.0mL/minでカラム溶出液と混合し反応させた。
HPLCには， HIT
ACHIL
7
1
0
0 (株)日立製作所)，蛍光
投与したニコチアナミンの動態を追跡するために，血中
検出器として HITACHIF
1
0
5
0 (~槻日立製作所)を使
ニコチアナミン濃度の定量を行った口まず，コントロー
用し，励起波長(広) 3
6
5nm，蛍光波長 (Em) 4
5
5nm
ルマウスの血援に 0.5μg/mLから 10.0μg/mLのニコ
で血築中ニコチアナミン濃度の分析を行った。
F
i
g
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e2
)。
チアナミンを添加し，検量線を作成した (
5
. 血築中 ACE活性測定法
ACE活性の測定は Cushman&Cheung9)の測定方法
を改良した国府ら 10) の方法に準じて行った。合成基質
その結果ヲ添加濃度とそのピーク面積の聞に相関係数
0
1
. 収縮期血圧の変化
THMの体重 2
0gあたり 1mgのニコチアナミンを単
回胃内投与して，経時的に血圧を測定し，その降圧効果
i
g
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e1に示した。コント
について検討した結果を F
3
5
.
6:
t4.7mmHgで
ロール群の投与前の収縮期血圧は 1
4時間まで有意な血圧変動は認め
あり，純水投与後， 2
3
2
.
1:
t
られなかった。ニコチアナミン投与群は，投与前 1
5.7mmHgから投与 1時間後には 1
1
5
.
5:
t12.0mmHg
まで有意な低下を示した。その後，投与 6時間まで有意
な血圧降下が観察された。
2
. 血中ニコチアナミン濃度
ニコチアナミン投与後の血圧降下が観察されたので，
0
.
9
9以上の良好な直線関係が得られた。
F
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e3にニコチアナミン投与後の THM血撲を分
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ニコチアナミンがつくば高血圧マウスに及ぼす影響
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は検出されなかった。なお，結果には示さなかったが，
投 与 1時間後の血援について LC-MSによる分析を行
析した代表的なクロマトグラムを示した。 F
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e3(
A
)
い，ニコチアナミンであることを確認した。
はコントロール群， F
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e3(
B
) は投与後 1時間で採
すべての個体の血中ニコチアナミン濃度の分析結果を
i
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e3(
C
)， (
D
) は，それぞれ，投与後 6
血した群， F
F
i
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e4に示した。投与後 1時間において，血祭 1mL
時間および 2
4時間に採血した群である。投与後 1時間
あたり 2.9μgと最も高く，血圧降下作用の持続した投
および 6時間においてそれぞれ明瞭なニコチアナミンの
与 6時間後には 0.8μgと低下した。投与 2
4時間後には
ピークが検出されたが，投与後 2
4時間においてピーク
ニコチアナミンは検出されなかった。
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系の ACEを阻害する物質の存在が見出され，高血圧自
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然発症ラットに対する経口投与で顕著な血圧降下作用を
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。
示すその物質は大豆由来のニコチアナミンであることが
。
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推定された。
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われわれは，高血圧の予防，予後に有効な食品成分の
ーっとして，植物中に含まれる高血圧抑制物質の検索を
行ってきた。そして，数種の植物中よりニコチアナミン
の精製単離を行い，その血圧上昇抑制作用について追跡
してきた 4一九ニコチアナミンについては，ラットを用
いた急性投与および反復投与により安全性についても検
討されている(佐藤ら，未発表データ)。ヒトが摂取す
3
. 血築および組織 ACE活性
る上での利点としては，ニコチアナミンは植物界に広く
投与ニコチアナミンの吸収および、血中への移行が確認
分布するため，通常の食事における摂取が容易であるこ
されたので，その RA系への影響を追跡するために，
とが挙げられ，高血圧発症抑制あるいは予防成分として
血築および組織の ACE活性を調べた。
の効果が期待される。
F
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e5にニコチアナミン投与後， 0
，1
， 6時間にお
前報において，種々の植物中のニコチアナミンの定量
ける血築 ACE活性の測定結果を示した。ニコチアナミ
法を確立したのでペ実際の献立を作成しその中に含ま
ン投与前が 3
4
4
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8.
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mLで，投与 1時 間 後 に
れるニコチアナミンの量を定量し，現在日常の食事にお
おいて 1
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.
8:
:
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いて高血圧予防あるいは軽症高血圧者の食事療法に寄与
4
7.
6:
:
t34.8mU/mL
さらに，投与 6時間後においても 2
することを目的として，検討を行っている(声津ら，未
と投与前に比較して有意に低い値を維持した。血中へ移
発表データ)。今回は，生体内におげるニコチアナミン
行したニコチアナミンが血祭 ACE活性に影響していた
の降圧機序およびその吸収挙動を探ることを目的とし
ことが明らかになった。
胸部大動脈，心臓，肺および腎臓の ACE活性の測定
結果を F
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e6に示した。投与後 1時間では，肺にお
いて有意ではないものの低下が認められ，また，大動脈
て，ヒト RA系充進型マウスである高血圧発症成因の
明らかな THMを用いて降圧作用と吸収について検討
を行った。
降圧作用については，ニコチアナミンを単回胃内投与
および腎臓についても同様の傾向が観察された。投与後
した後，投与後 1時間から 6時間まで有意な血圧降下作
6時間においては腎臓において有意な抑制が確認され
用が確認され，高血圧の成因が RA系の充進という単
ニコチアナミンがつくば高血圧マウスに及ぼす影響
3
1
9
一因子により高血圧を発症するマウスに対して血圧降下
は
， ACEが律速酵素として重要な役割を果たしている
作用を示したことより，ニコチアナミンが生体内におい
ことが示唆されている 24)0 THMにおいてはニコチアナ
て RA系を抑制したことが確認された。
ミンが血中に吸収され，血援 ACE活性，肺および腎
そこで，生体内における吸収挙動を探るために，血中
ACE活性を抑制し， THMの血圧降下に関与すること
ニコチアナミン濃度の定量を行った。胃内投与後，吸収
が推察されたが，それぞれの明確な役割等については今
された血中ニコチアナミン濃度は，投与後 1時間で最も
後更なる検討が必要である。
高く，投与 6時間後にはそれより低いものの血中の存在
要 約
が確認された。この結果は，血圧の抑制作用と一致して
おり，ニコチアナミンの投与により吸収されたニコチア
1
1週齢のつくば高血圧マウスを用いてニコチアナミ
ナミンが血中の RA系を抑制したことにより血圧を低
ン単回投与による高血圧抑制作用について検討を行っ
下させた可能性が示された D
た
。
ACEは
， RA昇 圧 系 に お い て ア ン ギ オ テ ン シ ン I
I)をアンギオテンシン I
I(
A
I
I
) に変換すると同時
(A
に，カリクレインーキニン降圧系の最終産物であるキニ
1
) ニコチアナミン投与後 1時間から 6時間まで有意
な血圧低下作用が観察された。
2
) BSA/ODSプレカラムを用いたイオン対高速液
ンを不活性化する酵素である川。近年では，循環血中以
体クロマトグラブイーにより，ニコチアナミン投与後の
外にも肺，心臓，腎臓，副腎，大動脈および脳などの局
血中ニコチアナミン濃度を追跡した。投与後 1時間にお
所組織における独立した RA系として存在し，循環 RA
いてニコチアナミンの血中濃度が最も高く， 6時間後に
系とは独立した調節を受けていることも明らかとなって
きている 15)。
4時間後には血中に検出されなかった。
は低下し， 2
THMにおいては今回，血中ニコチアナミン濃度と血
築 ACE活性が平行しており，投与後 1時間から 6時間
抑制され，それは血圧降下が持続した投与後 6時間まで
における降圧作用の発現は，血中に取り込まれたニコチ
3
) THMの血築 ACE活性は，投与後 1時間で最も
続いた口
4
) 組織 ACE活性については，肺において投与後 1
アナミンが THMの血築 ACE活性を阻害したことによ
時間で有意に低下し，投与後 6時間では腎において有意
る可能性が示唆された。
な活性低下が示された。
SHRの場合においては，大動脈血管の ACE活性は
高く， ACE阻害剤による降圧作用と大動脈血管の ACE
に対する阻害効果がよく相関することが報告されてい
る16)17)0 THMにおいては，ニコチアナミン投与により
以上の結果より，ニコチアナミンは， THMに対して
降圧作用を示すこと，そして血築 ACEおよび肺，腎臓
の組織 ACEに対して抑制作用を及ぽしたことが示唆さ
れた。
大動脈血管の ACE活性に低下傾向はみられたものの有
意な差ではなかった。一方，肺において投与 1時間後，
腎臓においてはそれより遅れて投与 6時間後に有意な
ACE活性の低下を示した
D
これらの結果は SHRの場
合と異なった。
これまで報告された降圧作用を有する食品由来の機能
性成分としては，イワシタンパク質由来の Y・2投与に
より心臓，胸部大動脈，肺，腎臓の ACE活性を低下さ
せ 18)，オニオンエキス，タマネギエキスにより心臓，腎
臓 ACE活性を減少させ 19)，ノリオリゴペプチドでは動
脈組織の ACE活性が低下し川また，魚を投与した SHR
では血管組織の ACE活性が抑制され血管壁肥大・弾性
低下の改善に有効であることが見出されている 2九 こ れ
らの局所的な RA系は長期的な調節因子として働き，
心血管リモデリングに重要であることも知られてい
る2九 THMは生後 6週齢ですでに高血圧を発症し，そ
の血管壁は血管平滑筋の形質転換による血管リモデリン
グを生じており，大動脈血管壁の肥厚が観察される問。
組織 ACEは膜結合型で生体内では血管内膜に多く存在
し，とくに肺血管床に多いことが知られている。循環
A
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I産生系における律速酵素はレニンであるが，組織特
I
I産生系において
異的に発現調節がされている組織 A
文 献
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) 高血圧治療ガイドライン 2
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日本高血圧学会，東京.
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) 林あつみ，中山知子，青柳康夫，木元幸一 (
2
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0
5
)
ハヤトウリからのニコチアナミン単離精製とその定
量法の確立.日本食品科学工学会誌 5
2，1
5
4
9
.
7
) 木 下 恵 美 子 ， 山 越 純 ， 菊 池 護 ( 19
9
4
) 醤油中の
血圧降下物質について.日本醸造協会昔、 8
9，1
2
6
3
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.
8
) FukamizuA，TakimotoE，SugimuraK，HataeT，
SeoMS，TakahashiS，SugiyamaF，KajiwaraN，
YamamiK，Murakami K (
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アンギオテンシン系と高血圧， p
社，東京.
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)松本均，伊藤恭子，山岸恵，中村裕子，徳永隆
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) 高血圧自然発症ラットを用いた α-トコ
ブエロールとイワシタンパク質由来ペプチド併用に
よる血圧調節作用の解析.日本食品科学工学会誌
5
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4
6
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.
2
0
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4
) 自然発生
1
9
) 斉藤嘉美，吉成織絵，五十嵐喜治 (
高血圧ラットとヒト高血圧症例におげるカボチャエ
キスとタマネギエキスの併用による血圧降下作用.
臨床医薬 2
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.
2
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)
2
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) 斉藤雅信，長屋恵子，萩野浩志，川合正允 (
ラットを用いた海苔オリゴペプチドの降圧作用.医
3，5
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8
.
学と薬学 4
) Mural
王a
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ニコチアナミンがつくば高血圧マウスに及ぽす影響
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