シーズ集配布用平成１８年度シーズ発掘試験採択課題０５－０６３の研究成果ライフサイエンス RNA 干渉を調節する２本鎖 RNA 結合タンパク質 ―２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質がダイサーの活性を調節する― キーワードＲＮＡ干渉、２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＲＢ、ダイサー、２本鎖ＲＮＡ研究概要 RNA 干渉は、真核生物全般に広く保存された生体防御機構で、遺伝子発現解析技術や医療分野への応用が期待されている。RNA 干渉は、長い２本鎖 RNA によって誘導され、長い２本鎖ＲＮＡがダイサー(ＤＣＬ)と２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢ）複合体によって 21-24 塩基の低分子ＲＮＡ(miRNA, siRNA)に切断される過程が最も重要である(図１)。本研究において、モデル植物シロイヌナズナ由来の５種類の２本鎖ＲＮＡタンパク質 (DRB1-5)の遺伝子を単離し、組換えタンパク質として大腸菌で産生・精製することに成功した。この２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質の２本鎖ＲＮＡ結合活性、ダイサーと相互作用する活性、ダイサー活性を調節する活性を見出した。長鎖２本鎖ＲＮＡ DCL1 DRB1 DCL4 DRB4 切断 21-24 塩基対低分子ＲＮＡ (miRNA, siRNA) DCL2 DRB2 DCL3 DRB3 DRB5 ＲＩＳＣターゲットmRNA 図１ＲＮＡ干渉の模式図植物の４種類のダイサー(DCL1-4)と５種類の２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質(DRB1-5)は、長鎖の２本鎖ＲＮＡが切断され低分子ＲＮＡ(miRNA, siRNA)が産生される反応にはたらく。Ｈ１８課題番号：０５-０６３ＪＳＴイノベーションサテライト茨城セールスポイントシロイヌナズナ由来の５種類の２本鎖ＲＮＡタンパク質(DRB1-5)の遺伝子を単離、GST 融合タンパク質として大腸菌で効率よく生産し簡便にアフィニティークロマトグラフィーで精製することに成功した。同様に、シロイヌナズナ由来の４種類のダイサー(DCL1-4)のＣ末端側の活性ドメインや２本鎖ＲＮＡ切断タンパク質(RNase III, RTL2)についても、組換えタンパク質として大腸菌から効率よく精製することに成功した。これらの組換えタンパク質や植物からの精製したタンパク質をもちいて、２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質(DRB1-5)の２本鎖ＲＮＡ結合活性、ダイサーと相互作用する活性、ダイサー活性を調節する活性を見出した（図２）。 A SDS-PAGE B dsRNA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 94 67 43 30 kD Lane 1 DCL1 Lane 2 DCL2 Lane 3 DCL3 Lane 4 DCL4 Lane 5 DRB1 Lane 6 DRB5 Lane 7 DRB2 Lane 8 DRB4 Lane 9 OsDRB1 Lane 10 GST 図２ダイサー（ＤＣＬ）と２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢ）の精製と２本鎖ＲＮＡ結合活性Ａ．シロイヌナズナのダイサー(DCL1-4)および２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質(DRB1,2,4,5)、イネの２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質(OsDRB1)を精製し SDS-PAGE で確認した。Ｂ．それらのタンパク質の２本鎖ＲＮＡ結合活性をノースウエスタン法で確認した。レーン１、５－９のタンパク質に２本鎖ＲＮＡ結合活性が認められた。将来の展望や応用・用途２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質 DRB は、２本鎖ＲＮＡ特異的結合活性を有することから、細胞内の微量な２本鎖ＲＮＡを単離・生成するタンパク質（ツール）として有望である。２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質ＤＲＢは、ダイサーと特異的に結合することから、生体内からダイサーを単離・生成するタンパク質（ツール）として有望である。ＲＮＡ干渉は、ウイルス等に対する生体防御機構として知られていることから、植物体内でも RNA 干渉を調節する活性がある２本鎖ＲＮＡ結合タンパク質ＤＲＢは、ウイルス防除資材として有望である。研究者研究テーマ東京農工大学福原敏行内在性２本鎖ＲＮＡレプリコン(Endornavirus)の研究植物のストレス応答機構の研究